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产品介绍

产品简介
    双分子荧光互补 (BiFC)是一项可直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术利用在荧光蛋白特定位点插入外源片段而不影响GFP荧光活性的特性,在其分割为两个无荧光活性的蛋白片段, 即N端片段(N-fragment)和C端片段(C-fragment),当能够发生相互作用的两个蛋白分别与N端片段和C端片段连接形成融合蛋白并在活细胞中共同表达时, 荧光蛋白的N端片段与C端片段就能够相互靠近, 重新形成活性的荧光基团而发出荧光。

 

BiFC系统

双分子荧光互补系统

 

1. YFP普通型:
该系统适合蛋白相互作用较强的蛋白互作研究,YFP荧光强度控制在较低的水平,不受背景等因素干扰。


2. YFP增强型:
该系统适合膜蛋白互作等蛋白之间相互作用较弱的蛋白互作研究,YFPn和YFPc经过人工编辑,YFP荧光增强,便于观察互作弱的荧光信号。同时对206位氨基酸A进行突变成K,降低了背景等因素干扰,结果真实可靠。

 

服务流程

服务流程

 

1.构建包含目的蛋白的质粒;
需客户确认目的蛋白在荧光蛋白的N端还是C端。
2.重组目的质粒转化农杆菌;
3.农杆菌菌液注射烟草叶片;
4.共聚焦显微镜观察和拍照。

 

项目交付标准

交付标准

1、完整的实验报告,包括详细的实验步骤及结果

2、原始图片,包含YFP、 DIC、Merge

3、构建好的质粒及农杆菌

案例展示

实验目的:通过BIFC实验验证A、B蛋白能相互作用。

实验设计:
A:(GFP组) pCAMBIA1300-35S-GFP(GFP)
B:(阳性组) pCAMBIA1300-35S-YN173-P1(YN173-P1) + pCAMBIA1300-35S-YC155-P2(YC155-P2)
C:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173(YN173) +pCAMBIA1300-35S-YC155(YC155)
D:(实验组) pCAMBIA1300-35S-YN173-A(YN173-A)+pCAMBIA1300-35S-YC155-B(YC155-B)
E:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173-A(YN173-A)+pCAMBIA1300-35S-YC155(YC155)
F:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173(YN173)+pCAMBIA1300-35S-YC155-B(YC155-B)


如图所示,GFP蛋白正常表达,有荧光信号;阳性对照组有荧光信号;阴性对照组均没有荧光信号;YN173-A与YC155-B共转染后,能明显观察到荧光,由此可知A蛋白与B蛋白存在互作。

图片展示

产品简介
    双分子荧光互补 (BiFC)是一项可直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。该技术利用在荧光蛋白特定位点插入外源片段而不影响GFP荧光活性的特性,在其分割为两个无荧光活性的蛋白片段, 即N端片段(N-fragment)和C端片段(C-fragment),当能够发生相互作用的两个蛋白分别与N端片段和C端片段连接形成融合蛋白并在活细胞中共同表达时, 荧光蛋白的N端片段与C端片段就能够相互靠近, 重新形成活性的荧光基团而发出荧光。

 

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

双分子荧光互补系统

 

1. YFP普通型:
该系统适合蛋白相互作用较强的蛋白互作研究,YFP荧光强度控制在较低的水平,不受背景等因素干扰。


2. YFP增强型:
该系统适合膜蛋白互作等蛋白之间相互作用较弱的蛋白互作研究,YFPn和YFPc经过人工编辑,YFP荧光增强,便于观察互作弱的荧光信号。同时对206位氨基酸A进行突变成K,降低了背景等因素干扰,结果真实可靠。

 

服务流程

 

1.构建包含目的蛋白的质粒;
需客户确认目的蛋白在荧光蛋白的N端还是C端。
2.重组目的质粒转化农杆菌;
3.农杆菌菌液注射烟草叶片;
4.共聚焦显微镜观察和拍照。

 

交付标准

1、完整的实验报告,包括详细的实验步骤及结果

2、原始图片,包含YFP、 DIC、Merge

3、构建好的质粒及农杆菌

实验目的:通过BIFC实验验证A、B蛋白能相互作用。

实验设计:
A:(GFP组) pCAMBIA1300-35S-GFP(GFP)
B:(阳性组) pCAMBIA1300-35S-YN173-P1(YN173-P1) + pCAMBIA1300-35S-YC155-P2(YC155-P2)
C:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173(YN173) +pCAMBIA1300-35S-YC155(YC155)
D:(实验组) pCAMBIA1300-35S-YN173-A(YN173-A)+pCAMBIA1300-35S-YC155-B(YC155-B)
E:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173-A(YN173-A)+pCAMBIA1300-35S-YC155(YC155)
F:(阴性组) pCAMBIA1300-35S-YN173(YN173)+pCAMBIA1300-35S-YC155-B(YC155-B)


如图所示,GFP蛋白正常表达,有荧光信号;阳性对照组有荧光信号;阴性对照组均没有荧光信号;YN173-A与YC155-B共转染后,能明显观察到荧光,由此可知A蛋白与B蛋白存在互作。

图片展示

电话:400-863-8520;025-5767-1761

邮箱:order@bestofbest.top

地址:南京市栖霞区江苏生命科技园F7栋

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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