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酵母信号肽跟踪筛选技术

▼服务简介

采用酵母信号肽筛选(yeast signal peptide screen YSST)验证信号肽的分泌功能。试验中选用的酵母菌株为缺失蔗糖转化酶基因、在以蔗糖为唯一碳源的培养基上不能生长的 YTK12。选用的载体质粒为含有色氨酸合成基因和一个缺失信号肽与起始密码子 ATG 的蔗糖转化酶基因(SUC2)的 pSUC2。 当一个具有功能的信号肽连接到 pSUC2的蔗糖转化酶基因之前时可以恢复蔗糖转化酶的分泌功能,从而使 YTK12菌株可在以棉子糖为碳源的缺陷型培养基上生长。 此外, TTC显色反应也常用于验证结果。

▼实验方案

1、通过 SignalP预测候选分泌蛋白的信号肽区域,设计引物,构建到 pSUC2载体上,载体抗性为氨苄抗性。

2、YTK12菌株在 YPDA培养上划线培养,将构建好的相应载体导入 YTK12,涂布在 CMD-W(缺色氨基酸)培养基平板上培养 。

3、挑取阳性克隆到棉子糖为碳源的 YPRAA培养基上,培养 。如果转接后的酵母细胞在YPRAA培养基上能够生长,那么就证明信号肽具有分泌功能;如果不能生长,则证明信号肽无分泌功能。

4、将上述步骤中的阳性转化株用CMD-W培养液培养,收集细胞悬浮液离心去上清,将沉淀用重悬液重悬,37℃孵育 10min。离心后取上清液加入TTC于试管中,以未转化的YTK12酵母菌作为对照,观察颜色变化情况照相记录。如果颜色变红,证明信号肽具有分泌功能。

▼实验结果

 

酵母信号肽跟踪系统验证信号肽分泌活性
(Xu et al., Nat. Commun., 2019)

▼参考文献

1、Xu Q, Tang C, Wang X, Sun S, Zhao J, Kang Z, Wang X. (2019). An effector protein of the wheat stripe rust fungus targets chloroplasts and suppresses chloroplast function. Nat Commun 10, 5571.
2、Yin W, Wang Y, Chen T, Lin Y, Luo C. (2018). Functional evaluation of the signal peptides of secreted proteins. Bio-protocol 8(9): e2839. DOI: 10.21769/BioProtoc.2839.

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