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膜系统酵母文库构建及筛选

▼服务简介

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

▼服务简介

DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来,是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,泛素可以分成两部分表达,即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系,断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白,且两个蛋白之间存在相互作用。它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法,使得分析膜蛋白间的互作成为现实。

其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选,也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证

▼实验原理

1、泛素(ubiquitin)可以分成两部分:N端(Nub)和C端(Cub);

2、Nub与Cub有很强的亲和力,当在同一细胞同时表达时,Nub与Cub会结合形成完整的泛素,会被泛素蛋白酶(UBPs)识别并切割;

3、Nub第三位的异亮氨酸突变成甘氨酸后(NubI→NubG),Nub与Cub的亲和力大大降低。

4、Cub融合转录因子LexA-VP16,诱饵构建在Cub上,猎物构建在NubG上;

5、当诱饵与猎物互作,使得Cub与NubG靠近而形成完整的泛素,UBPs识别并切割;

6、被切下的转录因子LexA-VP16 进入核内,启动报告基因(His,Ade,LacZ)的表达。

 

▼技术优势

1、在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号

2、使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化

3、蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动,而不是靠转录,因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列

4、此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用

5、任何一种膜蛋白都可以作为诱饵,能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位在细胞质内

 

▼诱饵载体选择方法

N-terminal

C-terminal

Vector

胞内(inside)

胞外(outside)

pBT3-N

胞外(outside)且含信号肽

胞内(inside)

pBT3-SUC

胞外(outside)不含信号肽

胞内(inside)

pBT3-STE

胞内(inside)

胞内(inside)

pBT3-N或pBT3-STE

注:若N端和C端都位于胞外,可截短使得C端出现位于胞内段,再选择相应载体

▼服务内容

服务类型

实验内容

交付内容

文库构建

1. 提取样本总RNA

2. cDNA合成与扩增

3. 将cDNA连接到pPR3N载体上

4. 将连接好文库载体电转化大肠杆菌感受态细胞

5. 收集文库及文库质量检测

 

1.  酵母文库甘油5ml EP管(4管)

2.  酵母文库质粒1.5ml EP(4管 >200ug)

3.  Word文档电子版项目报告(含实验数据)

文库承诺达到以下指标:

      文库库容量>1*10^7CFU

      平均插入片段0.8--1.5 kb (因物种而异)

      空载率<5%

      文库质粒>200ug

 

文库筛选

 

将Bait-PBT3载体转化到NMY51宿主细胞获得

Bait-PBT3 NMY51细胞

将文库质粒共转化到Bait-PBT3–NMY51细胞

摸索试用适当的筛选压力进行文库筛选并测序

 

1.  阳性克隆测序结果(根据测序结果而定)

2.  阳性克隆酵母序列>15个

3.  Word文档电子版项目报告(含实验数据)

▼应用前景

该技术可以解决信号转导通路,离子通道,受体,细胞增殖分化,病毒侵染宿主,等许多重要的生物学问题,也可以为新药发现寻找到合适的生物靶标,设计药物。

▼案例展示

泛素分离蛋白的酵母双杂交系统研究水稻磷转运蛋白间的互作

本文使用基于分裂泛素膜系统酵母双杂交(Y2H)分析,测试其余31个候选物与OsPT8的相互作用。鉴定OsPP95为与OsPT8相互作用的候选蛋白磷酸酶。在Y2H分析中,OsPP95与OsPT8和OsPT2相互作用。为了鉴定Osp95的PT相互作用结构域,Osp95蛋白被分为OsPP95NT(氨基酸1至36,含有独特的Osp95序列)和OsPP95CT(氨基酸37至290,包括保守的PP2C催化结构域),表明OsPT2和OsPT8都与OsPP95的氮端相互作用,但不与碳端相互作用。

图:分离泛素Y2H分析PP95和磷酸转运蛋白PT8及PT2之间的相互作用

参考文献:Zhili Y ang a, #, Jian Y anga,b,#,*, Y an Wanga, Fei Wanga, Wenxuan Maoa, Qiuju Hea, Jiming Xua, Zhongchang Wua, Chuanzao Maoa,*. PROTEIN PHOSPOHATASE 95 Regulates Phosphate Homeostasis by Affecting Phosphate Transporter Trafficking in Rice. Plant Cell Advance Publication. 2020, doi:10.1105/tpc.19.00685

 

▼常见FAQ

1、酵母双杂实验过程中如何选择核体系或者膜体系?

主要是根据所关注的诱饵蛋白在细胞内的定位情况来确定:

1) 诱饵基因是定位在膜上的蛋白,则选择膜体系文库;

2) 诱饵基因是定位于核,则选择核体系文库;

3) 诱饵基因是定位在细胞质,可以选择核体系或者膜体系文库

 

2、分离泛素膜系统的优点有哪些?缺陷有哪些?

分离的泛素系统优点

研究的蛋白质之间的相互作用发生在细胞膜或细胞质,而不是细胞核中 , 因此使得在细胞质和细胞膜中行使生理功能的蛋白质相互作用的研究得到广泛的应用, 在一定程度上弥补了传统的酵母双杂交系统的缺陷。

报告蛋白也可以选用其他性质的蛋白 (如酶 ) ,这样就可以通过检测酶活性来分析蛋白质间的相互作用。

分离的泛素系统的局限

在文库筛选结合蛋白时通常存在着假阳性较高的缺陷。因此,用该系统筛选出来的相互作用蛋白尚需采用免疫共沉淀等方法进一步加以证实;

 

3、膜系统酵母双杂文库如何选择诱饵载体?

膜系统酵母双杂根据诱饵基因的蛋白跨膜方式选择不同的载体,可以根据如下网站预测蛋白结构进行选择:

http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

上面的这两个网站可以分析膜蛋白的细胞内和细胞外区域。

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

这个网站可以具体分析蛋白的信号肽序列,以及N端是否存在cleavge site

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