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ABA 信号途径调节的新机制

英文标题Nucleocytoplasmic Trafficking of the Arabidopsis WD40 Repeat Protein XIW1 Regulates ABI5 Stability and Abscisic Acid Responses

中文标题:拟南芥重复WD40结构域蛋白XIW1的核质转运调节ABI5稳定性和脱落酸反应

文章作者:朱国辉教授课题组

发表单位华南农业大学生命科学学院

期刊:Molecular Plant,IF=10.8

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研究背景:

今天为大家解读一篇ABA 信号途径调节的新机制。

调节蛋白质核质转运往往是细胞信号转导的重要环节之一,参与植物对生物节律、激素、非生物和生物胁迫的响应。核转运受体(NTR)介导蛋白质的入核和出核转运,包括核输入受体(Importin)和核输出受体(Exportin)。XPO1/CRM1是核输出受体,介导蛋白质从细胞核向细胞质的转运。植物中XPO1底物蛋白鉴定及其底物蛋白核质转运的生物学意义少有报道。

 

研究结果

1:寻找到XPO1A的互作蛋白:XIW1

通过对XPO1A转基因植株蛋白的免疫共沉淀见图和质谱分析,鉴定了一个富含WD40结构域的蛋白XIW1见图

转基因植株蛋白的免疫共沉淀富含WD40结构域的蛋白

2:XIW1的出核转运依赖与XPO1

证据一:在烟草和转基因材料的实验表明,LMB(XPO1抑制剂)处理或者对XIW1蛋白NES序列(核输出序列)点突变,会促使XIW1在细胞核积累。(见图

点突变,会促使XIW1在细胞核积累

证据二:通过酵母双杂实验表明:XPO1A是通过XIW1蛋白NES序列发生互作。(见图

酵母双杂实验表明:XPO1A是通过XIW1蛋白NES序列发生互作

综上:表明XIW1的出核转运依赖与XPO1。

 

3.XIW1基因的表型特征

研究发现,XIW1功能缺失突变体xiw1-1表现为ABA不敏感表型,

突变体xiw1-1表现为ABA不敏感表型

那为什么xiw1表现为ABA不敏感表型??作者联系到一类植物脱落酸不敏感蛋白ABI5

4:XIW1与ABI5的协同性

名词解释:植物脱落酸不敏感蛋白5(Abscisic acid-insensitive 5, ABI5)为碱性亮氨酸拉链类型(Basic leucine zipper, bZIP)的转录因子,在ABA信号途径中起重要作用。

ABA处理条件下xiw1中ABI5转录和蛋白水平低于野生型;

RNA-seq结果表明xiw1-1与abi5有类似的基因表达谱,遗传学证据表明ABI5介导了XIW1对ABA信号响应的调节。

xiw1-1与abi5有类似的基因表达谱

5:应用领域意义

研究进一步发现,XIW1是一个核质分布蛋白。拟南芥在正常生长条件下时,XIW1主要定位于细胞质,而ABA处理或者非生物胁迫可促使XIW1在细胞核内聚集。XIW1在细胞核内与ABI5存在直接互作,并起到减缓ABI5降解速率的作用,从而正调节ABA信号途径。

XIW1减缓ABI5降解速率的作用

因此,该研究解析了XPO1-XIW1-ABI5信号级联过程,阐明了一种通过蛋白核质转运调节ABA信号途径的新机制;同时,过量表达XIW1或者促使XIW1在细胞核内表达,均可提高植物的抗旱性,有一定的应用前景。

过量表达XIW1或者促使XIW1在细胞核内表达,均可提高植物的抗旱性

结论

该研究在拟南芥中鉴定了一个XPO1互作蛋白XIW1(XPO1-Interacting WD40 protein 1),XIW1的出核转运依赖于XPO1。ABA和逆境胁迫影响XIW1的核质转运,XIW1在细胞核的积累可增强ABI5的稳定性,从而正调节ABA信号途径。

 

 

ABA 信号途径调节的新机制
调节蛋白质核质转运往往是细胞信号转导的重要环节之一,参与植物对生物节律、激素、非生物和生物胁迫的响应。而植物中XPO1底物蛋白鉴定及其底物蛋白核质转运的生物学意义少有报道。该研究在拟南芥中鉴定了一个XPO1互作蛋白XIW1(XPO1-Interacting WD40 protein 1),XIW1的出核转运依赖于XPO1。ABA和逆境胁迫影响XIW1的核质转运,XIW1在细胞核的积累可增强ABI5
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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