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脱落酸激素诱导拟南芥幼苗中花青素的合成


中文标题脱落酸激素诱导拟南芥幼苗中花青素的合成

文章作者:陈俊洁,梅松,胡彦如

发表单位热带植物资源可持续利用重点实验室 中国科学院

 

背景

近年研究发现,ABA激素能够促进某些植物果实中花青素的合成和积累,例如,通过施加外源激素可激活或抑制花青素合成相关基因的表达来控制水果中花青素的积累。但是ABA激素为什么能影响花青素的合成和积累的分子机制,研究报道较少。


背景知识:

1:参与花青素合成途径的基因可分为结构基因和调控基因两类。结构基因包括早期生物合成基因(如CHS、CHI和F3H)和晚期生物合成基因(如DFR、ANS和UF3GT)

2:MYB、bHLH和WD40调控因子通常形成三元MBW复合物发挥调节作用,直接调控花青素合成基因的表达,如DFR、BAN、LDOX、TT12、TT19和AHA10

研究内容:

本研究以拟南芥为实验材料,进一步探究了ABA对植物花青素合成的分子机制。本研究发现,野生型拟南芥植物在不同浓度ABA处理时幼苗茎尖花青素的积累明显增多,且与ABA浓度的变化呈正相关。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验进一步验证了ABA处理能够导致LODX、DFR和UF3GT等花青素合成结构基因的表达量升高,并且随着ABA浓度的增加呈递增趋势。

进一步研究发现,ABA促进花青素的合成可能部分依赖于MBW复合体中的核心转录因子,如TTG1、TT8及MYB75等。蛋白相互作用实验发现MYB75、MYB113、TT8和TTG1等蛋白能与ABI5转录因子相互作用,从而在分子水平证明了ABA信号途径与花青素合成之间的内在联系。

综上所述,本研究初步揭示了ABA激素信号调控拟南芥幼苗花青素合成的分子机制。 

实验思路:

1、表型测定:ABA处理下花青素含量测定

ABA处理下花青素含量测定

1 ABA诱导野生型拟南芥幼苗中花青素的合成。随着ABA浓度增加,花青素含量增加,表明花青素的积累与ABA浓度的变化呈正相关

2、基因表达量测定:监测ABA处理条件下,与花青素相关基因表达量变化

ABA处理条件下,与花青素相关基因表达量变化

2 ABA诱导拟南芥花青素合成相关基因的表达

结果显示,在ABA处理的植物中,C4H、DFR、LODX和UF3GT等花青素结构基因的表达显著增加,并且随着ABA浓度增加呈正相关关系。除此之外,MYB75、MYB90、TT8、GL3、EGL3、TTG1、TT2和HY5等调节基因的表达水平也受ABA的诱导。上述实验结果说明,ABA激素能够通过上调某些花青素合成相关基因的表达水平来诱导拟南芥幼苗中花青素的合成。

 

3、通过BiFC和Y2H实验,建立花青素相关基因与ABA相关基因联系

花青素相关基因与ABA相关基因联系

 

图3:ABA相关的ABI5转录因子与花青素合成相关的调控基因TT8、MYB75和TTG1等蛋白在酵母中相互作用

试验中将相关的诱饵质粒和猎物质粒共转入酵母细胞中,结果显示ABI5与MYB75、MYB90、MYB113、MYB114、TT8和TTG1在酵母细胞中均有强相互作用

 

综上所述,该研究认为ABA信号诱导拟南芥幼苗中花青素的积累,并可能通过ABI5与MBW复合体协同作用调控花青素的合成。

 

 

脱落酸激素诱导拟南芥幼苗中花青素的合成
近年研究发现,ABA激素能够促进某些植物果实中花青素的合成和积累,例如,通过施加外源激素可激活或抑制花青素合成相关基因的表达来控制水果中花青素的积累。但是ABA激素为什么能影响花青素的合成和积累的分子机制,研究报道较少。综上所述,该研究认为ABA信号诱导拟南芥幼苗中花青素的积累,并可能通过ABI5与MBW复合体协同作用调控花青素的合成。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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