通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白

英文标题:Identification of host proteins interacting withToxoplasma gondii, GRA15 (TgGRA15) by yeast two-hybrid system

中文标题:通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白

期刊:Parasites& Vector

 

背景介绍

弓形虫是一种专性的细胞内寄生虫,弓形虫感染是全球性的公共卫生挑战,据报道,全球约有三分之一的人是慢性弓形虫感染携带者。

弓形虫可以通过分泌多态性效应蛋白(如ROPs和GRAs)来调节宿主的信号通路,从而维持其在宿主细胞内的繁殖和生存。其中的一个效应蛋白--TgGRA15,可以激活NF-κB通路,进而促进与免疫反应相关的一系列基因的转移,这些功能均与非特异性免疫机制紧密相关。

此外,TgGRA15还可以影响鼠科动物细胞中GBP1(guanylate binding protein 1)的积累。TgGRA15在弓形虫的发病机理中发挥着重要作用,因此为了深入了解TgGRA15的功能,本研究利用酵母双杂研究与其互作的宿主蛋白。

 

结果分析

1、诱饵质粒的构建

将total RNA反转录成cDNA,利用特异性引物对TgGRA15基因片段进行PCR扩增,扩增产物用pMD19-T载体连接后用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化。纯化后连接至EcoR1和BamH1位点的pGBKT7载体,然后将质粒(命名为pGBKT7-TgGRA15)转化至大肠DH5α,用核酸内切酶和测序验证。结果如下图所示。

     诱饵质粒的构建

2、TgGRA15诱饵质粒的表达、自激活和毒性检测

酵母双杂筛选之前,先对融合蛋白的表达进行验证。提取pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒转化酵母Y2HGold总蛋白,然后用western blotting进行检测,结果表明GRA15诱饵质粒融合蛋白的相对分子质量与预估值(57 kDa)一致。

pGBKT7诱饵质粒转化到Y2HGold细胞中,然后在缺陷性培养基SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA中培养。在SD/-Trp板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上不能生长,说明转化成功,酵母菌株Y2HGold不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能。此外,用诱饵质粒和空载pGBKT7转化的酵母菌株Y2HGold的菌落大小基本一致,因此pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒可用于后续的酵母双杂筛选。

 诱饵质粒表达、自激活和毒性检测

3、以TgGRA15作为诱饵进行酵母双杂筛选

利用mating法进行筛选。将含有pGBKT7-TgGRA15质粒的Y2HGold与Y187细胞(携带有Mate & Plate Universal Mouse (Normalized) cDNA文库)进行配对。基于不同的培养基的克隆数,mating效率为6.8%和5 × 106,生长在DDO/X/A平板的72 colonies中有18个变蓝。然后,这18个蓝色克隆转移到更严格的QDO/X/A平板上。结果发现有8个克隆仍然变蓝了。prey plasmids就从可能的阳性互作中分离出来,然后转化到大肠杆菌DH5α中。随后进行PCR扩增,结果如下图a。对互作的特异性验证发现,所有的zygotes在QDO/X/A平板上均变蓝。随后为了剔除假阳性,用含有空载体pGBKT7的Y2HGold与转化了prey plasmid的Y187菌株mate,发现C2和C7在QDO/X/A平板上不生长。含有pGADT7-T的Y187(control)与含有pGBKT7-53的Y2HGold进行mate有蓝色克隆,但Y187与含有空载pGBKT7的Y2HGold进行mating无菌落生长。以上结果表明两个宿主蛋白与TgGRA15有相互作用。

 酵母双杂筛选

4、测序和分析

为了确定阳性克隆的同一性,两个prey plasmids用T7引物进行测序。测序结果用BLAST分析,发现这两个inserts与两个小鼠基因(AW209491,Luzp1)有100%的序列一致性。测序结果也表明,AW209491包含能使其编码的100个残基片段融合到GAL4的DNA结合域,Luzp1含有能编码104个残基的区域。之前没有研究报道过这两个蛋白与TgGRA15有相互作用。Luzp1是有注释的已知蛋白,但AW209491的功能目前是未知的。Luzp1的生化过程分析表明它与系统发育(动脉形成、神经褶弯曲和心室间隔的形成)密切相关。Luzp1与胞外区和细胞核也相关。 

 

总结

本研究利用酵母双杂筛选第一次发现了与弓形虫TgGRA15有相互作用的宿主蛋白Luzp1和AW209491,Luzp1包含3个细胞核定位信号,且与宿主的非编码RNA基因的调节有关。这些细胞靶点的鉴定以及对宿主-病原体相互作用的了解,可以作为防治弓形虫感染的新的治疗和预防策略的基础。

 


 

通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白
弓形虫是一种专性的细胞内寄生虫,弓形虫感染是全球性的公共卫生挑战。本研究利用酵母双杂筛选第一次发现了与弓形虫TgGRA15有相互作用的宿主蛋白Luzp1和AW209491,可以作为防治弓形虫感染的新的治疗和预防策略的基础。
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