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通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白

英文标题:Identification of host proteins interacting withToxoplasma gondii, GRA15 (TgGRA15) by yeast two-hybrid system

中文标题:通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白

期刊:Parasites& Vector

 

背景介绍

弓形虫是一种专性的细胞内寄生虫,弓形虫感染是全球性的公共卫生挑战,据报道,全球约有三分之一的人是慢性弓形虫感染携带者。

弓形虫可以通过分泌多态性效应蛋白(如ROPs和GRAs)来调节宿主的信号通路,从而维持其在宿主细胞内的繁殖和生存。其中的一个效应蛋白--TgGRA15,可以激活NF-κB通路,进而促进与免疫反应相关的一系列基因的转移,这些功能均与非特异性免疫机制紧密相关。

此外,TgGRA15还可以影响鼠科动物细胞中GBP1(guanylate binding protein 1)的积累。TgGRA15在弓形虫的发病机理中发挥着重要作用,因此为了深入了解TgGRA15的功能,本研究利用酵母双杂研究与其互作的宿主蛋白。

 

结果分析

1、诱饵质粒的构建

将total RNA反转录成cDNA,利用特异性引物对TgGRA15基因片段进行PCR扩增,扩增产物用pMD19-T载体连接后用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化。纯化后连接至EcoR1和BamH1位点的pGBKT7载体,然后将质粒(命名为pGBKT7-TgGRA15)转化至大肠DH5α,用核酸内切酶和测序验证。结果如下图所示。

     诱饵质粒的构建

2、TgGRA15诱饵质粒的表达、自激活和毒性检测

酵母双杂筛选之前,先对融合蛋白的表达进行验证。提取pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒转化酵母Y2HGold总蛋白,然后用western blotting进行检测,结果表明GRA15诱饵质粒融合蛋白的相对分子质量与预估值(57 kDa)一致。

pGBKT7诱饵质粒转化到Y2HGold细胞中,然后在缺陷性培养基SD/-Trp,SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA中培养。在SD/-Trp板上生长良好,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上不能生长,说明转化成功,酵母菌株Y2HGold不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能。此外,用诱饵质粒和空载pGBKT7转化的酵母菌株Y2HGold的菌落大小基本一致,因此pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒可用于后续的酵母双杂筛选。

 诱饵质粒表达、自激活和毒性检测

3、以TgGRA15作为诱饵进行酵母双杂筛选

利用mating法进行筛选。将含有pGBKT7-TgGRA15质粒的Y2HGold与Y187细胞(携带有Mate & Plate Universal Mouse (Normalized) cDNA文库)进行配对。基于不同的培养基的克隆数,mating效率为6.8%和5 × 106,生长在DDO/X/A平板的72 colonies中有18个变蓝。然后,这18个蓝色克隆转移到更严格的QDO/X/A平板上。结果发现有8个克隆仍然变蓝了。prey plasmids就从可能的阳性互作中分离出来,然后转化到大肠杆菌DH5α中。随后进行PCR扩增,结果如下图a。对互作的特异性验证发现,所有的zygotes在QDO/X/A平板上均变蓝。随后为了剔除假阳性,用含有空载体pGBKT7的Y2HGold与转化了prey plasmid的Y187菌株mate,发现C2和C7在QDO/X/A平板上不生长。含有pGADT7-T的Y187(control)与含有pGBKT7-53的Y2HGold进行mate有蓝色克隆,但Y187与含有空载pGBKT7的Y2HGold进行mating无菌落生长。以上结果表明两个宿主蛋白与TgGRA15有相互作用。

 酵母双杂筛选

4、测序和分析

为了确定阳性克隆的同一性,两个prey plasmids用T7引物进行测序。测序结果用BLAST分析,发现这两个inserts与两个小鼠基因(AW209491,Luzp1)有100%的序列一致性。测序结果也表明,AW209491包含能使其编码的100个残基片段融合到GAL4的DNA结合域,Luzp1含有能编码104个残基的区域。之前没有研究报道过这两个蛋白与TgGRA15有相互作用。Luzp1是有注释的已知蛋白,但AW209491的功能目前是未知的。Luzp1的生化过程分析表明它与系统发育(动脉形成、神经褶弯曲和心室间隔的形成)密切相关。Luzp1与胞外区和细胞核也相关。 

 

总结

本研究利用酵母双杂筛选第一次发现了与弓形虫TgGRA15有相互作用的宿主蛋白Luzp1和AW209491,Luzp1包含3个细胞核定位信号,且与宿主的非编码RNA基因的调节有关。这些细胞靶点的鉴定以及对宿主-病原体相互作用的了解,可以作为防治弓形虫感染的新的治疗和预防策略的基础。

 


 

通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白
弓形虫是一种专性的细胞内寄生虫,弓形虫感染是全球性的公共卫生挑战。本研究利用酵母双杂筛选第一次发现了与弓形虫TgGRA15有相互作用的宿主蛋白Luzp1和AW209491,可以作为防治弓形虫感染的新的治疗和预防策略的基础。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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