中文标题：通过酵母双杂交系统鉴定与弓形虫GRA15相互作用的宿主蛋白

期刊：Parasites& Vector

背景介绍：

弓形虫可以通过分泌多态性效应蛋白（如ROPs和GRAs）来调节宿主的信号通路，从而维持其在宿主细胞内的繁殖和生存。其中的一个效应蛋白--TgGRA15，可以激活NF-κB通路，进而促进与免疫反应相关的一系列基因的转移，这些功能均与非特异性免疫机制紧密相关。

此外，TgGRA15还可以影响鼠科动物细胞中GBP1（guanylate binding protein 1）的积累。TgGRA15在弓形虫的发病机理中发挥着重要作用，因此为了深入了解TgGRA15的功能，本研究利用酵母双杂研究与其互作的宿主蛋白。

结果分析：

1、诱饵质粒的构建

将total RNA反转录成cDNA，利用特异性引物对TgGRA15基因片段进行PCR扩增，扩增产物用pMD19-T载体连接后用限制性内切酶EcoRI和BamHI消化。纯化后连接至EcoR1和BamH1位点的pGBKT7载体，然后将质粒（命名为pGBKT7-TgGRA15）转化至大肠DH5α，用核酸内切酶和测序验证。结果如下图所示。

2、TgGRA15诱饵质粒的表达、自激活和毒性检测

酵母双杂筛选之前，先对融合蛋白的表达进行验证。提取pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒转化酵母Y2HGold总蛋白，然后用western blotting进行检测，结果表明GRA15诱饵质粒融合蛋白的相对分子质量与预估值（57 kDa）一致。

pGBKT7诱饵质粒转化到Y2HGold细胞中，然后在缺陷性培养基SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA中培养。在SD/-Trp板上生长良好，在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上不能生长，说明转化成功，酵母菌株Y2HGold不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能。此外，用诱饵质粒和空载pGBKT7转化的酵母菌株Y2HGold的菌落大小基本一致，因此pGBKT7-TgGRA15诱饵质粒可用于后续的酵母双杂筛选。

3、以TgGRA15作为诱饵进行酵母双杂筛选

利用mating法进行筛选。将含有pGBKT7-TgGRA15质粒的Y2HGold与Y187细胞（携带有Mate & Plate™ Universal Mouse (Normalized) cDNA文库）进行配对。基于不同的培养基的克隆数，mating效率为6.8%和5 × 106，生长在DDO/X/A平板的72 colonies中有18个变蓝。然后，这18个蓝色克隆转移到更严格的QDO/X/A平板上。结果发现有8个克隆仍然变蓝了。prey plasmids就从可能的阳性互作中分离出来，然后转化到大肠杆菌DH5α中。随后进行PCR扩增，结果如下图a。对互作的特异性验证发现，所有的zygotes在QDO/X/A平板上均变蓝。随后为了剔除假阳性，用含有空载体pGBKT7的Y2HGold与转化了prey plasmid的Y187菌株mate，发现C2和C7在QDO/X/A平板上不生长。含有pGADT7-T的Y187（control）与含有pGBKT7-53的Y2HGold进行mate有蓝色克隆，但Y187与含有空载pGBKT7的Y2HGold进行mating无菌落生长。以上结果表明两个宿主蛋白与TgGRA15有相互作用。

4、测序和分析

为了确定阳性克隆的同一性，两个prey plasmids用T7引物进行测序。测序结果用BLAST分析，发现这两个inserts与两个小鼠基因（AW209491，Luzp1）有100%的序列一致性。测序结果也表明，AW209491包含能使其编码的100个残基片段融合到GAL4的DNA结合域，Luzp1含有能编码104个残基的区域。之前没有研究报道过这两个蛋白与TgGRA15有相互作用。Luzp1是有注释的已知蛋白，但AW209491的功能目前是未知的。Luzp1的生化过程分析表明它与系统发育（动脉形成、神经褶弯曲和心室间隔的形成）密切相关。Luzp1与胞外区和细胞核也相关。 

总结

本研究利用酵母双杂筛选第一次发现了与弓形虫TgGRA15有相互作用的宿主蛋白Luzp1和AW209491，Luzp1包含3个细胞核定位信号，且与宿主的非编码RNA基因的调节有关。这些细胞靶点的鉴定以及对宿主-病原体相互作用的了解，可以作为防治弓形虫感染的新的治疗和预防策略的基础。