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OsBELL4A 调控水稻 WOX 家族基因表达及 水稻幼苗生长和耐逆

中文标题:OsBELL4A 调控水稻 WOX 家族基因表达及 水稻幼苗生长和耐逆

文章作者:高雅迪 秦华

发表单位:中国农业科学院生物技术研究所

中文核心期刊 中国农业科技导报

 

研究背景:

转录调控能够改变基因表达水平,进而调控生物自身生长发育以及响应逆境胁迫。目前水稻中鉴定到 2300个转录调控因子按照蛋白结构它们被分为不同的家族,如 MYC 家族 MYB 家族、WRKY 家族、AP2/EREBP 家族和TALE 家。其中,TALE 家族包含两个亚家族: KNOX 和 BELL BELL 家族在水稻根系发育及逆境胁迫应答中的功能研究

 

研究思路

本研究通过拟南芥序列比对在水稻中鉴定到 4 个 BELL4同源基因,并对它们同源基因的启动子元件进行了分析。进一步又对水稻幼苗根中BELL4源基因在不同激素和非生物胁迫处理条件下的表达模式进行了分析。同时利用OsBELL4的干扰材料分析了其在水稻根系发育中的功能及其与 WOX 家族间的调控关系。

 

背景知识

1: 植物根系是植物与土壤接触的部分,也是研究植物适应环境,应对逆境胁迫的理想模型对植物整个生长发育过程都起着重要作用。

2BELL家族成在分生组织和花器官发、芽尖分生组织的起始和维持、叶片发、开花、卵细胞分化和珠被发育等生物学过程中发挥重要的功能。

主要结果:

1:水稻中BELL4启动子中含有响应脱落酸、乙烯、赤霉素和生长素的元件

对水稻BELL4同源基因起始密码子 ATG 上有2kb 启动子区域进行分析,发现4个基因的启动子中含有响应脱落酸、乙烯、赤霉素和生长素的元件表明 BELL 蛋白水稻中发挥功能受到植物激素或者外界环境的 调控

 

BELL4 基因启动子序列分析

图注:BELL4 基因启动子序列分析

 

2:不同激素对水稻根系中 BELL4 同源基因的影响

不同激素处理下水稻的同源基因表达

图注:不同激素处理下水稻 BELL4 同源基因的表达分析

水稻根系100 μmol/L IAA ACC处理下OsBELL4B、OsBELH4A、 OsBELH4A 和 OsBELH4B表达量迅速下调在 10 μmol/L GA3处理下OsBELL4B 和 OsBELH4A的表达量急剧下调, OsBELHB 表达量显著升高。ABA 对于OsBELH4A 和 OsBELH4B 表达的促进作用并不明显,抑制12 h 部分解除。说明水稻根系中的 BELL4 同源基因均能快速响应响应乙烯、生长素、赤霉素及脱落酸等植物激素

3:非生物胁迫对水稻根系中 BELL4 同源基因的影响

干旱、低温和盐处理条件下水稻 BELL4 同源基因的表达模式分析

图注:干旱、低温和盐处理条件下水稻 BELL4 同源基因的表达模式分析

对日本晴幼苗根系进行干旱、低温及盐处干旱处理抑制了 OsBELL4A 和 OsBELH4A 表达,而诱导 OsBELH4B 的表达,对 OsBELL4B 的表达无显著影响。在低温胁迫下 OsBELL4A 和 OsBELL4B 的基因表达有上调的趋势,后期表达量又会受到抑制而 OsBELH4A 和 OsBELH4B 则一直呈现下调的趋势。在盐胁迫下,OsBELH4A和 OsBELH4B分别在胁迫0.5 h和6 h出现了上调趋势, OsBELL4A 和 OsBELL4B 基因表达都呈下调趋势。这种不同的表达模式说明水稻根BELLE同源基因参与这些激素信号介导的生长发育进程及抗逆性。

 

4OsBELL4A RNAi 干扰转基因植株的表型分析 WOX 家族基因的表达分析

OsBELL4A 的 RNAi 干扰转基因植株苗期根表型

OsBELL4A 的 RNAi 干扰转基因植株苗期根表型

OsBELL4A 的 RNAi 干扰转基因植株的根系生长情况与野生型( NIP) 有较明显的差异OsBELL4A 参与调控水稻幼苗根系的发育,抑OsBELL4A 的表达可以促进冠根的发育并延缓初生根的伸长。

转基因植株中的表达水平

图注:OsWOX 基因家族在 OsBELL4A RNAi转基因植株中的表达水平

OsBELL4A 的两个干扰株系 RI-49 和RI-58都表现出冠根数量增加而主根的长度下降的表并且在这两个株系OsWOX9 的表达量都较 野生增 加,说明 OsBELL4AOsWOX9基因表达的调控很有可能是导致 OsBELL4A RNAi干扰转基因植株冠根数增加的 原因。

 

结论

BELL 家族基因在水稻根系中参与多种植物激素信号转导及逆境胁迫应答反应,并且 OsBELL4A 在水稻根发育中起到调控作用,这种作用与 OsWOX 家族基因表达有很大相关性。该研究丰富了 BELL 家族基因的功能,为探究 BELL家族在水稻根系发育及逆境胁迫应答中的功能奠定基础。

 

OsBELL4A 调控水稻 WOX 家族基因表达及 水稻幼苗生长和耐逆
BELL 家族基因在水稻根系中参与多种植物激素信号转导及逆境胁迫应答反应,并且 OsBELL4A 在水稻根发育中起到调控作用,这种作用与 OsWOX 家族基因表达有很大相关性。该研究丰富了 BELL 家族基因的功能,为探究 BELL家族在水稻根系发育及逆境胁迫应答中的功能奠定基础。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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