水稻 OsVDAC6 的表达及亚细胞定位

中文标题:水稻 OsVDAC6 的表达及亚细胞定位

文章作者:龚秋涵,覃永华,刘学群,刘新琼,李开,王春台

发表单位:中南民族大学生命科学学院

中文核心期刊分子植物育种

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文章摘要

本研究构建原核表达载体,体外诱导表达可溶性融合蛋白 His-OsVDAC6,通过 SDS-PAGE 和 WesternBlot 检测到 49 kDa 大小的目的蛋白。同时构建瞬时表达载体,转化水稻原生质体后,通过荧光观察,证明OsVDAC6 定位于线粒体,为后续 OsVDAC6 互作蛋白的筛选及功能研究提供了依据。长期以来认为 VDAC蛋白作为一种膜蛋白存在于线粒体外膜上,但随着研究的深入,人们发现 VDAC 不仅存在于线粒体, 在细胞膜和细胞其他组分中也能检测到。例如哺乳动物细胞肌质网、植物细胞叶绿体以及质膜上都存在 VDAC蛋白;水稻 OsVDAC6 的定位尚未被报道,但 OsVDACs 蛋白家族中部分蛋白被定位, OsVDAC1 和 OsVDAC4 定位于细胞质, OsVDAC5 定位于内质网。这些结果均证明了 VDAC 蛋白的定位具有多样性,说明 VDAC 的功能具有多样性,在多种生命活动中发挥重要的作用。

结论

本实验利用了荧光蛋白分子量较小、与其他蛋白融合后荧光不受影响的特性,通过荧光蛋白表达的位置推测融合蛋白的定位是近年来常用的方式,操作简单,结果直观。但是实验过程中存在一定的困难,例如黄化苗的选择,需选取 MS 固体培养基上培养 10~13 d 的黄化苗,时间太短或太长均会影响荧光的观察;配制原生质体提取相关试剂时,要正确使用容量瓶等较精密的容器,保证配制的浓度准确,以免影响原生质体的形状;操作过程中确保动作轻柔,避免造成原生质体的损坏;蛋白表达时间过长会形成蛋白聚集从水稻 OsVDAC6 的表达及亚细胞定位而影响定位的分析,造成定位的错误判断。本实验通过 OsVDAC6-GFP 融合蛋白与线粒体 Marker 共定位,从而确定 OsVDAC6 定位于线粒体,笔者认为还需要将 OsVDAC6 蛋白与其他细胞器 Marker 共转水稻原生质体,进一步精确地研究其定位,分析定位与功能的关系,推测、分析其发挥功能的机制,为后续实验的设计及分析提供依据。

水稻原生质体亚细胞定位实验图片展示

原生质体亚细胞定位

水稻 OsVDAC6 的表达及亚细胞定位
本实验通过 OsVDAC6-GFP 融合蛋白与线粒体 Marker 共定位,从而确定 OsVDAC6 定位于线粒体,笔者认为还需要将 OsVDAC6 蛋白与其他细胞器 Marker 共转水稻原生质体,进一步精确地研究其定位,分析定位与功能的关系,推测、分析其发挥功能的机制,为后续实验的设计及分析提供依据。
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