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采用酵母双杂交系统筛选梨 PbTMT4 互作因子

中文标题:采用酵母双杂交系统筛选梨 PbTMT4 互作因子

文章作者:程寅胜,杨 立,陈健秋

发表单位:湖北省农业科学院果树茶叶研究所

发表期刊: 湖 北 农 业 科 学

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文章摘要:

酵母双杂交技术系统(Yeast two-hybrid system)是一种建立于酵母体内的用于分析研究蛋白质结构之间可以相互促进作用的基因信息系统。研究蛋白质之间的相互作用,蛋白质功能可以揭示分子水平上,而另一方面,植物生长,必不可少的生活发展,分化和凋亡规律,植物的调节机制,新的蛋白质功能的发现和建立蛋白质-蛋白质相互作用网络提供了重要的理论依据。它具有灵敏度高的优点,可以描述蛋白质之间的微弱、瞬时作用。初步研究筛选出的PbTMT4基因相互作用的因素,包括参与植物生长和发育,调整可逆富含半胱氨酸蛋白的植物根系生长和根毛形成三足鼎立,5个蛋白具有生物防御或非生物胁迫,包括具有重金属解毒功能富含半胱氨酸的蛋白质可以改善转基因植物反向转运蛋白,除去过量的自由基在植物过氧化物酶的Na盐,碱性亮氨酸拉链转录因子及效果具有组蛋白修饰;与参与生殖生长3个植株,抑制花粉管伸长的CRP超家族因素和诱导快速碱化柱头花粉管生长取向/粘附风格富含半胱氨酸,开花控制组蛋白,靶向的于雄配子体开花的Rossmann折叠超家族蛋白的表达; 还有一些影响进行细胞间信号传导的磷脂酶。这些初步结果表明,在PbTMT4参与生活的复杂的代谢过程,包括营养生长,生殖生长,环境压力和信号转导等生命过程的植物。液泡膜单糖转运蛋白(Tonoplast monosaccharide transporter,TMT)是定位于液泡膜的单糖转运蛋白,负责糖在胞质和液泡之间的转运,属于协助扩散超家族(Major facilitator superfamily,MFS),也称为共转运蛋白家族,在所有的生物中都有发现。

研究结果:

酵母双杂

结论:

确定了梨中六个TMT家庭成员(PbTMT1-PbTMT6),以及PbTMT4基因密切相关的糖在果实发育和成熟过程中的积累,是一个重要的候选基因,影响果实品质。 随后进行研究结果表明,PbTMT4 定位于液泡膜上,能够得到显著水平提高转基因植物糖含量, 同时对植株的生长发育发展具有重要促进社会作用。 逆境处理发现PbTMT4转基因株系受到的损伤小于野生型植物,表明该基因可能在抗NEA胁迫中发挥重要的调控作用。本研究中所希望的酵母双杂交技术,采用梨果cDNA文库,筛选初始交互因子PbTMT4提供基本糖传输机制,并且在该基因供进一步研究植物生长和发育的分子调控的。

采用酵母双杂交系统筛选梨 PbTMT4 互作因子
酵母双杂交技术系统(Yeast two-hybrid system)是一种建立于酵母体内的用于分析研究蛋白质结构之间可以相互促进作用的基因信息系统。研究蛋白质之间的相互作用,蛋白质功能可以揭示分子水平上,而另一方面,植物生长,必不可少的生活发展,分化和凋亡规律,植物的调节机制,新的蛋白质功能的发现和建立蛋白质-蛋白质相互作用网络提供了重要的理论依据。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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