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核盘菌转录因子 SsMCM1 原核表达与亚细胞定位

中文标题:核盘菌转录因子 SsMCM1 原核表达与亚细胞定位

文章作者:王雪亮 刘言志 吕兴明

发表单位:吉林大学植物科学学院

发表期刊:植物病理学报


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研究内容:

  核盘菌是一类寄主范围广泛的植物病原真菌。MADS-box家族基因作为一类重要的转录因子广泛存在于生物中,该家族转录因子VdMcm1在轮枝菌中与微菌核形成、致病性有关,转录因子Bcmads1在灰葡萄菌中对菌核形成及致病力方面具有重要作用,转录因子FgMcm1在镰刀菌中与菌丝生长有关,转录因子MoMcm1在稻瘟菌中也与致病性有关。与核盘菌菌丝生长、菌核形成、致病力调控、子实体形成等相关的其他基因也有发现,如Forkhead-box基因家族、bZIP转录因子Ss-Adal等。在作用机制上发现MADS-box家族基因与交配型蛋白、细胞周质酶、黑色素形成、细胞生长调节、纤维素合成等方面有关。然而MADS-box家族基因在核盘菌生命活动中的调节机理是什么,与发现的Forkhead-box基因家族、bZIP转录因子Ss-Adal等之间是否有联系,调控网络是否有交集,具体如何调控等问题对研究核盘菌的生长发育研究具有重要的意义,对该类菌物的防治也有重要的价值。现今亚细胞定位的主要方法有生物信息学预测定位、融合报告基因定位法、免疫组织化学定位法、蛋白质组学技术、共分离标记酶辅助定位等。蛋白间相互作用的研究方法主要有生物信息学分析、Pull-down技术、酵母双杂交技术双分子荧光互补技术、Co-IP免疫共沉淀、串联亲和层析、凝胶阻滞电泳等技术。本研究纯化得到的SsMCM1蛋白、制备的抗血清、荧光亚细胞定位重组子,可作为Pull-down技术、Co-IP免疫共沉淀、双分子荧光互补技术实验材料,从而进一步探索SsMCM1蛋白互作网络,解析该转录因子的作用机理。

研究结果:

荧光亚细胞定位  

结论:

本研究通过生物信息学分析,提取核盘菌不同组分蛋白并利用抗血清特异性结合使用Westernblot检测,利用农杆菌侵染烟草进行瞬时表达完成亚细胞定位分析3种手段完成了SsMCM1的亚细胞定位分析,确定了转录因子SsMCM1定位于细胞核。大多数蛋白自身不能够独立发挥其职能,须与其他蛋白质相互作用形成蛋白复合体,才能在生物体中发挥相应的生理功能。基于这些互作关系,以及所有互作蛋白的作用机制,研究蛋白质组中蛋白间相互作用网络,才能真正意义上阐明一个蛋白质的功能。

核盘菌转录因子 SsMCM1 原核表达与亚细胞定位
蛋白间相互作用的研究方法主要有生物信息学分析、Pull-down技术、酵母双杂交技术、双分子荧光互补技术、Co-IP免疫共沉淀、串联亲和层析、凝胶阻滞电泳等技术。本研究纯化得到的SsMCM1蛋白、制备的抗血清、荧光亚细胞定位重组子,可作为Pull-down技术、Co-IP免疫共沉淀、双分子荧光互补技术实验材料,从而进一步探索SsMCM1蛋白互作网络,解析该转录因子的作用机理。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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