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三倍体枇杷花期调控基因 EjSPL5 的克隆、亚细胞定位及表达分析

中文标题:三倍体枇杷花期调控基因 EjSPL5 的克隆、亚细胞定位及表达分析

文章作者:孙伟雄  石 敏  薛宝贵

发表单位:西南大学农业科学研究院

发表期刊:园艺学报

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研究摘要:

本研究中首次从三倍体枇杷‘Q27’中分离得到SPL基因家族的EjSPL5,该基因编码的氨基酸序列与苹果、拟南和金鱼草均具有保守的SBP结构域。编码的EjSPL5蛋白包含1个由79个保守氨基酸残基构成的SBP结构域,该结构域为典型的锌指结构,包含Cys-Cys-His-CysCys-Cys-Cys-His两个锌指结构位点,且在SBP结构域的C端有1个与第2个锌指结构有部分重叠的核定位信号。研究表明,金鱼草AmSBP1和AmSBP2均含有两个锌指结构,并且存在C3H或C2HC序列模型;同时,在梨和猕猴桃的研究中也证明SBP结构域含有两个锌指结构和1个核定位信号。研究表明拟南SPL3、SPL4和SPL5和金鱼草SBP1和SBP2同源性较高。其中,AtSPL5在调控拟南营养生长到生殖生长转变,以及开花期起重要作用,AmSBP1和AmSBP2在花发育调控过程中均具有重要作用。系统进化树分析表明,EjSPL5和苹果MdSPL5同源蛋白聚类较近;这与传统分类学上枇杷与苹果同属于苹果亚科相吻合。EjSPL5在三倍体枇杷不同组织中均有表达,并且在萼片中的表达量最高,表明EjSPL5可能参与花器官形成和发育调控。前人研究表明,SPL转录因子参与维持植物生殖能力及萼片等花器官的伸长,以及维持雄性的可育性。EjSPL5在二倍体和三倍体枇杷的早、晚花品种中的表达特征表明,其花发育的前6个时期表达较高,花蕾露白期和盛花期的表达量较低,其中在花芽形态分化期的表达量显著增加。这与前人的研究相符合,表明EjSPL5参与花期调控可能发生在花芽分化阶段。同时,本研究中发现EjSPL5在三倍体和二倍体枇杷花发育不同时期的表达模式显著不同,其中在三倍体枇杷花芽形态分化期的表达量最高,而在二倍体枇杷在花序侧生支轴快速伸长期表达量最高。由此推测三倍体枇杷在花芽形态分化期EjSPL5的表达量增加可能导致其花芽提前分化,进而促进其早花。类似地,有研究表明,三倍体枇杷基因组发生大量的遗传变异和DNA甲基化修饰导致三倍体中大量基因呈现加性表达模式,导致其生长势显著高于二倍体枇杷。

研究结果:

亚细胞定位

研究结论:

本研究中还发现在早花枇杷中EjSPL5的表达量在各发育时期要高于晚花枇杷,尤其在花芽形态分化期EjSPL5的表达量要高于晚花枇杷。已有研究表明,不同早晚花枇杷品种间花期差异的原因是花芽分化的起始时间和花序发育的快慢不同。有研究表明,拟南中过表达AtSPL5可促进植株早花。由此,推测SPL5同源基因可能具有促进植物早花的作用。通过亚细胞定位试验表明EjSPL5定位在细胞核,这与报道中早熟PpSPL4定位在细胞核中的结果相一致,说明EjSPL5作为一种典型的转录因子基因,在细胞核中行使其功能。目前,三倍体枇杷花期调控的分子机制尚不清楚,本研究中从三倍体枇杷‘Q27’克隆得到EjSPL5基因,进而探讨了EjSPL5在三倍体和二倍体枇杷的早、晚花品种花发育过程中的表达模式差异,初步推测了EjSPL5在三倍体枇杷花发育过程中的作用。本研究的不足之处在于,缺乏EjSPL5转基因拟南植株功能验证,作者将通过蘸花侵染法获得EjSPL5转基因拟南植株对其生物学功能做进一步的研究。

三倍体枇杷花期调控基因 EjSPL5 的克隆、亚细胞定位及表达分析
本研究中首次从三倍体枇杷‘Q27’中分离得到SPL基因家族的EjSPL5,该基因编码的氨基酸序列与苹果、拟南芥和金鱼草均具有保守的SBP结构域。编码的EjSPL5蛋白包含1个由79个保守氨基酸残基构成的SBP结构域,该结构域为典型的锌指结构,包含Cys-Cys-His-Cys和Cys-Cys-Cys-His两个锌指结构位点,且在SBP结构域的C端有1个与第2个锌指结构有部分重叠的核定位信号。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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