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水稻硝态氮响应的酵母双杂交文库的构建与分析

中文标题:水稻硝态氮响应的酵母双杂交文库的构建与分析文章作者:洪广成, 陈 倩, 刘石锋, 张汉马, 秦小健

发表单位: 重庆师范大学

中文核心期刊 生 物 学 杂 志

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研究结论

cDNA文库的质量取决于文库的代表性与完整性,而完整性的体现需要总RNA的高质量提取,在提取过程中几乎未发生RNA的降解,并且RNA高度纯化无杂质。本试验所用的总RNA经过纯化处理后的电泳图片28S和18S条带清晰,表明总RNA的质量较高,可用于文库的构建。用SMART技术合成的dscDNA不需要对总RNA中的mRNA进行分离纯化,因而避免了mRNA的降解损失;反转的dscDNA再通过CHROMASPINTE-400柱子的纯化,去除小片段DNA,减少cDNA文库在整合外源片段时产生的不利因素。同时利用同源重组的方法将与pGADT7-Rec载体末端同源的dscDNA定向重组到pGADT7-Rec载体上,不仅可以有效避免繁琐的酶切连接等步骤,同时也解决了连接的低效性和克隆的嵌合问题,从而保证了cDNA文库整合外源dscDNA时的方向性和完整性。通过转化效率检测的结果达到3.23×106/3μgpGADT7-Rec满足实验所需条件,保证了试验文库的完整性和代表性。文库的插入片段大小在1500bp以下,说明大片段cDNA在同源重组时的效率较低,为以后的文库构建提供经验。本试验构建的水稻9311氮响应条件下的cDNA酵母文库,cDNA文库滴度1.7×108cfu/mL,插入的片段大小在500~1500bp之间,文库的质量符合筛选条件,可用于后续水稻氮吸收与利用关键基因互作蛋白筛选,为水稻氮素利用分子调控通路关键基因的挖掘提供帮助。

研究成果

文库构建

 

水稻硝态氮响应的酵母双杂交文库的构建与分析
本试验构建的水稻9311氮响应条件下的cDNA酵母文库,cDNA文库滴度1.7×108cfu/mL,插入的片段大小在500~1500bp之间,文库的质量符合筛选条件,可用于后续水稻氮吸收与利用关键基因互作蛋白筛选,为水稻氮素利用分子调控通路关键基因的挖掘提供帮助。
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