利用番茄 cDNA 酵母双杂交文库筛选 Pti4 互作蛋白

中文标题:利用番茄 cDNA 酵母双杂交文库筛选 Pti4 互作蛋白

文章作者:王 洋  张 政  王莹莹

发表单位:合肥工业大学食品科学与工程学院

中文核心期刊安徽农业科学

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研究内容

20世纪90年代酵母双杂交技术兴起,成为研究蛋白质之间相互作用的一种有效手段。该方法是基于观察到真核生物转录因子有2个可分离的结构域:DNA结合结构域(Bindingdomain,BD)、激活结构域(Activatingdomain,AD)。DNA结合域负责转录因子在特定基因组DNA序列上的结合,激活域的功能则是促进基因的转录。BD和AD并非一定要存在于同一蛋白质中才能发挥功能,这2个结构域在物理上是可分离的,当2个结构域非常接近时,目标基因的转录激活也会发生。由此,通过检测报告基因的激活表达情况来标示蛋白质之间是否存在相互作用。在此基础上,通过选择不同组织、发育阶段、诱导处理生物材料,对其所转录全部mRNA进行反转录获得cDNA片段与载体连接,形成特定条件下功能基因克隆的集合,构建酵母双杂交cDNA文库,使酵母双杂交技术不仅能检测已知蛋白质间的互作,还可从酵母文库中批量筛选与已知蛋白互作的未知蛋白,进而探究蛋白质间的互作及其所调控生命活动。构建高质量文库是筛选互作蛋白的前提和保障。该研究所构建番茄cDNA酵母双杂交文库容量、插入片段大小及阳性率检测结果均符合文库筛选的要求。

笔者进一步以番茄Pti4为诱饵蛋白进行互作蛋白文库筛选,初步获得了6个可能与Pti4互作的转录因子。它们涉及植物成熟、生长发育、环境胁迫应答等多种调控途径,这也与Pti4在番茄中的推测作用机制相吻合。当然,这些筛选靶标蛋白是否在植物体内能够与Pti4相互作用,还需后续试验在植物体系中进行验证,但仍提供了新的研究线索。而且,由于Pti4/5/6基因具有功能机制的相似性,该研究也为Pti基因在免疫防御、果实发育等方面功能机制研究奠定了基础

研究结果

酵母双杂

利用番茄 cDNA 酵母双杂交文库筛选 Pti4 互作蛋白
20世纪90年代酵母双杂交技术兴起,成为研究蛋白质之间相互作用的一种有效手段。该方法是基于观察到真核生物转录因子有2个可分离的结构域:DNA结合结构域(Bindingdomain,BD)、激活结构域(Activatingdomain,AD)。DNA结合域负责转录因子在特定基因组DNA序列上的结合,激活域的功能则是促进基因的转录。
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