400-863-8520

TEL    025-57671761

在线表单

  • 姓名: *

  • 单位: *

  • 电话: *

  • 邮箱: *

  • 服务项目: *

  • 备注:

  • 提交

  • 验证码
    看不清?换一张
    取消
    确定
图片展示

猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定


中文标题:猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

文章作者:李晓月  王春来  倪宏波

发表单位:黑龙江八一农垦大学动物科技学院

中文核心期刊:黑龙江八一农垦大学学报

文献下载

研究内容:

为了对HPSCDT三个亚基在致病方面的作用有一个全面和宏观的了解,我们以PK-15细胞为研究对象,利用猪的全基因组芯片microarray杂交方法检测了不同亚基处理后细胞的基因表达谱。结果提示CdtA亚基和CdtB亚基可能在与PK-15细胞结合方面更为重要,这要与之前报的其他细菌的CDT作用方式是不一致的。有一项结果提示C亚基也有可能进入细胞并发挥细胞毒作用,在抗氧化方面显示出了重要作用。对于不同的靶细胞,HPSCDT的不同亚基在于细胞结合以及细胞毒方面可能具有不同的作用。

蛋白相互作用对研究宿主互作方面有极其重要作用,有助于对已知全长基因但未知功能的基因的功能分析。酵母双杂交系统多用于检测已知蛋白间相互作用,可对研究基因功能验证闭。酵母双杂交操作可以巧妙的把复杂的蛋白互作转换成简易的核酸研究,并能进行高通量的蛋白筛选,为蛋白互作的研究提供了快捷的途径闭。

利用SMART技术构建PK-15细胞三框cDNA文库,用于筛选猪伪狂犬病病毒与宿主细胞间相互作用蛋白。但没有研究与HPSCDT不同亚基蛋白相互作用的,我们选用PK-15细胞模型,筛选与其相互作用的蛋白,对其筛选到的蛋白进行分析,阐释CdtA亚基、CdtB亚基及CdtC亚基在细胞结合方面及毒性方面,各亚基所起的作用。纯化的dscDNA经琼脂糖凝胶电泳检测,呈弥散分布,大小集中在250~2000范围内,符合建库的要求。从收集的文库鉴定可知,文库的容量、插入片段及文库的多态性,均达到筛选酵母双杂交互作蛋白的文库要求,此文库为今后筛选与HPSCDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白奠定了基础。

猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定
蛋白相互作用对研究宿主互作方面有极其重要作用,有助于对已知全长基因但未知功能的基因的功能分析。酵母双杂交系统多用于检测已知蛋白间相互作用,可对研究基因功能验证闭。酵母双杂交操作可以巧妙的把复杂的蛋白互作转换成简易的核酸研究,并能进行高通量的蛋白筛选,为蛋白互作的研究提供了快捷的途径闭。
长按图片保存/分享
图片展示

电话:400-863-8520;025-5767-1761

邮箱:order@bestofbest.top

地址:南京市栖霞区江苏生命科技园F7栋

图片展示

微信公众号

图片展示

微信小程序

版权所有 南京瑞源生物技术有限公司       苏ICP备20003978号      技术支持:飞色网络

Copyright © 瑞源生物

苏ICP备20003978号

实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

联系电话
400-8638520
联系电话
025-57671761
二维码
二维码