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酵母文库筛选--拟南芥 LBD15 互作蛋白的筛选和鉴定

文献题目:拟南芥 LBD15 互作蛋白的筛选和鉴定

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小编说,由中科院研究人员撰写的《拟南芥 LBD15 互作蛋白的筛选和鉴定》,其研发思路值得借鉴,作家主要利用遗传学和分子生物学深入研究LBD15蛋白的功能。


研究背景

利用LBD5筛选酵母文库,获得了48个互作的蛋白,这些蛋白参与了多个调控网络,涉及多个方面的功能,如细胞过程、代谢过程、刺激响应、生物过程的调控和发育过程等,证实了LBD功能多样性的作用机制。在筛选的48个互作蛋白种有1个Expansin-LikeA1(EXPLA)蛋白,但是AtLBD15和EXPLA作用机理还不了解。LBD18通过结合到EXP14和EXP17启动子上激活其表达,进而参与到生长素调控的侧根原基起始过程中[9]。而LBD15与EXPLA发生互作可能与茎顶端分生细胞伸展生长有关。二者之间的互作关系的机理研究对LBD15调控茎顶端分生组织发育的调控具有一定的意义。维管形成层细胞的表面受体是PXY(Phloemintercalatedwithxylem),其通过与亮氨酸的结合作用来介导维管组织的形成。

 

试验材料 拟南芥

研究思路

研究结果

酵母自激活

研究思路

筛选基因富集

 

研究结论

本试验筛到1个与AtLBD15互作的泛素结合酶E2-UBC6。推测AtLBD15和UBC6互作可能参与了刺激响应及免疫反应等。LBD家族蛋白在高等植物中分布广泛,在高等植物的生长发育过程中起着十分重要的作用,然而其功能的分子机制并不清楚。后续工作将主要获得拟南芥LBD15互作蛋白的遗传材料,利用遗传学和分子生物学深入研究LBD15蛋白的功能,以期更好地阐明其工作机理。

酵母文库筛选--拟南芥 LBD15 互作蛋白的筛选和鉴定
本试验筛到1个与AtLBD15互作的泛素结合酶E2-UBC6。推测AtLBD15和UBC6互作可能参与了刺激响应及免疫反应等。LBD家族蛋白在高等植物中分布广泛,在高等植物的生长发育过程中起着十分重要的作用,然而其功能的分子机制并不清楚。后续工作将主要获得拟南芥LBD15互作蛋白的遗传材料,利用遗传学和分子生物学深入研究LBD15蛋白的功能,以期更好地阐明其工作机理。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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