Front. Plant Sci|百脉根泛素连接酶SIE3与转录因子SIP1的相互作用

2020年6月12日，华中农业大学农业微生物学国家重点实验室的研究人员于上发表了题为“The Lotus japonicus Ubiquitin Ligase SIE3 Interacts With the Transcription Factor SIP1 and Forms a Homodimer”的研究文献，该文献揭示了百脉根中泛素连接酶SIE3与转录因子SIP1的相互作用并形成了二聚体。

背景：共生受体激酶SymRK在共生信号转导和结节器官生长中起重要作用。但如何将共生信号从SymRK传递到下游仍难以确定。在这里，我们用酵母双杂和烟草验证了SIE3与SIP1的相互作用。为进一步研究SymRK介导的信号通路的调控机制以及结节器官中E3连接酶的生物学功能提供了基础。

结果：

为了验证SIP1与SIE3是否存在相互作用，我们进行了酵母双杂交（Y2H）分析。酵母细胞BD-SIE3/AD-SIP1或AD-SIE3/BD-SIP1在四倍缺失SD培养基上生长，其β-半乳糖苷酶活性显著高于阴性对照。结果表明，酵母细胞中SIE3与SIP1存在相互作用。

图1.A.酵母细胞中SIE3和SIP1之间的相互作用.B.酵母细胞中蛋白质水平的免疫印迹分析。

在烟草中进行了双分子荧光互补（BiFC）分析以确定SIE3/SIP1相互作用是否在植物体内发生。结果表明SIP1和SIE3在植物中相互影响。

图2. A.植物中SIE3与SIP1的相互作用的BiFC测定.用表达SCC::SIP1和SIE3::SCN的土壤杆菌细胞共转染烟草叶.B.烟草中表达的蛋白质的免疫印迹分析.

在植物中观察到SIE3表达的高分子量，根据其大小，认为该条带可能对应于SIE3同型二聚体。进一步研究结果表明，上带对应于SIE3同二聚体，下带对应于单体，并且反应混合物中DTT的存在有助于稳定SIE3单体。

图3. DTT对SIE3二聚化的影响.

为了研究SIE3均二聚所需的肽结构域，使用Y2H分析来测试它们之间的相互作用。结果表明，CRA-RanBPM域对于SIE3的自我互作至关重要。

图4. A. SIE3的功能域及其突变体构建体.CTLH（对于LisH的C末端），CRA（对于CT11-RanBPM），RING（对于新基因）.SIE3-ΔRING缺少RING域，SIE3-ΔCR缺少CRA-RanBPM和RING域.B.酵母细胞中SIE3和SIE3缺失突变体之间的相互作用.将携带该构建体的酵母细胞置于SD/-Trp-Leu（SD-2）培养基上，并选择在SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-gal（SD-4或SD-4/X-gal）上进行蛋白质-蛋白质相互作用.p53/SV40和Lam/SV40的组合分别用作阳性和阴性对照.C.酵母细胞中SIE3-C266S和SIE3缺失突变体之间的相互作用.

假设Cys266可能是控制SIE3同型二聚化的关键残基,进一步研究表明，用Cys266取代了丝氨酸的SIE3无法在酵母或烟草细胞中形成同型二聚体。表明SIE3的二聚化是通过Cys266形成二硫键介导的。

图5. A.将烟草与表达SIE3::SCN和SCC::SIE3等的农杆菌细胞共转染，并与SCC :: C266S等组合阳性对照，而NFR5::SCN和SCC::C266S的组合用作阴性对照.B.烟草中表达的蛋白质的免疫印迹分析.

PCR分析表明，SIE3-OX或SIE3-C266S-OX毛状根中转基因的表达水平比对照高3–15倍。这些数据表明SIE3的半胱氨酸-266对于其在促进百脉根的结瘤中的是必不可少的。

图6. A.WT，SIE3-OX和SIE3-C266S-OX毛状根的根瘤表型.B.每株具有改变的SIE3和SIE3-C266S转录水平的转基因毛状根的根瘤数.C.对照SIE3-OX中SIE3转录水平的分析.D.Enod40-1的qPCR分析对照和转基因毛状根中的转录水平.

结果：

SIE3和SIP1在酵母细胞和植物体内相互作用，SIE3可以通过Cys266上的二硫键形成同型二聚体，并且SIE3在Cys266处的突变消除了其在共生中的作用。在反应过程中，SIE3单体可能已变成均二聚体。总之，SIE3似乎代表了植物中一种新型的二聚E3泛素连接酶。SIE3在百脉根促进根瘤形成中必不可少。本研究为SymRK，SIE3和SIP1之间的复杂关系提供了新的思路，并为进一步研究SymRK介导的信号通路的调控机制以及结节器官中E3连接酶二聚化的生物学功能提供了基础。

下载原文