Plant science|桑树基因MnANR和MnLAR增强转基因植物贵腐菌抗性

西南大学蚕基因组生物学国家重点实验室的何宁佳等在Plant science上发表了一篇题为“Mulberry genes MnANR and MnLAR confer transgenic plants with resistance to Botrytis cinerea”的研究文献，该文献揭示了桑树基因MnANR和MnLAR赋予转基因植物对贵腐菌的抗性。

背景：桑葚是一种栽培的水果作物，富含抗氧化剂，如花青素和PA。PA是强大的抗氧化剂，可清除细胞中的有害自由基。类黄酮是具有生物学功能的植物次生代谢产物，主要包含花色素苷，黄酮醇和原花青素（PAs）。原花青素（PAs）是桑树中与防御相关的主要酚类物质，PA可以通过其对心血管疾病和癌症的保护作用来改善人类健康，但其生物合成的基础机制尚未阐明。因此，研究桑树的PA生物合成途径可能对提高桑树果实品质具有重要意义。在这项研究中，我们报告了桑树中ANR和LAR基因的功能鉴定，通过在烟草中相应基因的异位表达，对其进行了功能鉴定。

结果：使用BLASTP对ANR和LAR的氨基酸序列进行比对，在桑树数据库中分别鉴定了与ANR和LAR高度相似的每个基因。系统树表明，这些酶聚集在两个不同的分支中。

图1.桑树和其他植物物种的LAR和ANR蛋白的系统发生树

qRT-PCR研究了MnANR和MnLAR的表达。在分析的组织中，MnANR和MnLAR表达趋势相对一致。叶片中MnANR和MnLAR的表达水平显著高于树皮，芽，花和果实。这可能与桑叶中儿茶素的大量积累有关。

图2.基于实时定量PCR分析的桑树组织中MnANR和MnLAR表达

在四个阶段研究了白色和红色桑葚的基因表达谱和类黄酮含量，显示出明显的差异。这些发现表明，具有不同颜色的桑树果实中PA的生物合成途径可能不同。在白桑葚中，PA含量先升高后降低，这与果实成熟阶段ANR和LAR基因表达的降低相一致。红桑葚中的PA含量呈现出持续增加的趋势，这可能与红桑果实成熟阶段的ANR基因表达水平增加有关。

图3.分析两个不同桑树品种基因表达和代谢物含量（A）两个桑树品种的果皮颜色.（B.C）MnANR和MnLAR表达的实时定量PCR分析（D.F）儿茶素，表儿茶素和PA含量

进一步分析发现， MnANR和MnLAR 表达水平受不同压力的影响，表明这两个基因对于桑树抗逆性可能很重要。

图4.桑叶接种灰霉病后MnANR和MnLAR的表达分析

在35S启动子的控制下，制备了包含MnANR和MnLAR编码序列的构建体，用于烟草转化，对转基因烟草植物的分析证实了MnANR和MnLAR的基因表达。为验证转基因烟草植物对贵腐菌的抵抗力，测试了粗提取物对贵腐菌的抗真菌活性。总体而言，烟草植物中MnANR和MnLAR的异位表达增强了对贵腐菌的抗性，这与这些基因在感染贵腐菌桑树植物中的诱导表达相一致。

图5.接种后转基因烟草的抗性.（A）转基因烟草植物叶片中转录水平的实时定量PCR分析.（B）野生型和转基因烟草叶片中可溶性PA含量.（C）在接种后3天拍摄被感染的烟草叶.（D）被感染的野生型（WT）和T₀转基因系的抗性的定量分析.（E）在补充有来自野生型（WT）和T₀转基因品系的粗提取物的培养基上抑制菌丝生长.（F）抑制作用的定量分析.

在营养生长阶段，野生型和转基因烟草植物之间没有明显的表型差异。然而，在开花期，转基因烟草植物的花为淡红色或白色，而野生型花则为红色。随后比较了野生型和转基因烟草品系的基因表达和类黄酮含量。

图6.MnANR和MnLAR在烟草中的异位表达.（A）野生型（WT）和T₀转基因株系的烟草花.（B）在转基因烟草品系的花中MnANR和MnLAR的表达谱.

通过 qRT-PCR分析以下基因的表达，研究了转基因烟草花中MnANR或MnLAR与其他类黄酮途径基因之间的相互作用。这些类黄酮途径基因在转基因烟草花中差异表达。这些基因表达的变化可能是转基因烟草植物中花色苷和黄烷-3-醇含量变化的原因。

图7.类黄酮相关结构生物合成基因在野生型（WT）和携带MnANR和MnLAR的 T ₀转基因烟草系花中的表达谱.

结论：在这项研究中，研究了在白色和红色桑树果实中编码花青素苷还原酶（ANR）或无色花青素苷还原酶（LAR）的基因表达与PA生物合成之间的关系。

烟草中MnANR和MnLAR的异位表达提高了对贵腐菌的抵抗力，实验表明，转基因烟草粗提取物对贵腐菌有明显的抑制作用。此外，ANR和LAR代表了用于提高桑树和相关植物对贵腐菌的抗性的潜在靶标。桑树ANR和LAR可以通过抑制二氢黄酮醇还原酶（DFR）和花青素合酶（ANS）基因的表达来降低烟草花中的花青素含量。这些发现可能与提高桑树对真菌病原体的抗性以及操纵桑树和相关植物物种中的类黄酮合成有关。这项研究的结果可能有助于阐明PA生物合成的机制。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2020.110473

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