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PNAS|北京大学利用合成生物学攻克真核细胞器中稳定固氮酶表达的障碍

PNAS|北京大学利用合成生物学攻克真核细胞器中稳定固氮酶表达的障碍

2020629日,北京大学生命科学院王忆平课题组于PNAS上发表了一篇题为“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”的研究文献,该文献揭示了利用合成生物学攻克真核细胞器中稳定固氮酶表达的障碍。

文章来源

背景:

通过直接导入nif基因在真核细胞中构建生物固氮作用,用合成生物学方法,确保活性固氮酶生物合成所需的组分是稳定的,并以适当的化学计量学方法表达。在这项研究中,我们划定了区域并确定了关键残基NifD-R98。在酵母线粒体中观察到来自四个代表性重氮营养菌的NifD蛋白,但不是其R98变体,不稳定。此外,通过在大肠杆菌重构来自酵母、稻、烟草和拟南芥的线粒体加工肽酶(MPPS),我们证明了MPP主导NifD的裂解。这些结果表明由于MPPs的切割对线粒体中NifD蛋白的稳定性具有普遍的影响。这种重建方法可能有助于预评估Nif蛋白在植物中的表达稳定性,并为植物细胞器中的活性氮酶铺平道路。

 

结果:

在酵母和烟草中观察到,NifD蛋白的N末端降解时NifD在核基因组中表达,并定位到特定的前导肽。根据NifD蛋白降解部分的迁移速率,预测蛋白酶介导的消化可能发生在NifDN端区域。用半乳糖诱导的启动子GAL1在酵母中表达,并以Su9引导肽作为线粒体靶标,发现91-100位氨基酸残基的缺失可以阻止NifD的降解。随后,在残基内构建了两个5-aa内部缺失。蛋白质稳定性分析表明,当在酵母线粒体中表达时,96100-aa的缺失变体和R98K变体均增加了NifD对蛋白酶介导的降解的耐受性。因此,R98是酵母线粒体中NifD降解的关键。

 

接下来,我们分析了70多个NifD序列,发现R98几乎在分析的所有NifD序列中都是保守的。然而,这些菌株不是编码NiFeNifN这两种合成FeMo-co所必需的基因,而且它们的NifDK序列具有离散性。因此,这些NifD样序列可能不属于真正的Mo固氮酶。由于R98在传统的固氮酶中是保守的,因此我们测试了其他重氮营养菌的NifD。发现不同来源的天然NifDs也被降解。显然,酵母线粒体中NifD的降解是普遍现象,而R98对蛋白酶的切割至关重要。

NifD中蛋白酶加工位点的分析

1.NifD中蛋白酶加工位点的分析

 

为了维持NifD活性,我们最初筛选了变体,其中98位的精氨酸被赖氨酸取代,后者是具有相似侧链特性的氨基残基。当将此突变引入大肠杆菌中基于操纵子的nif基因簇中,通过乙炔还原测定法进行测定时,仅获得了6.6%的固氮酶活性。为了解决这个问题,在此位置构建了一个饱和库以筛选既保留固氮酶活性又赋予酵母线粒体降解耐受性的合适氨基酸取代。结果活性最高的氨基酸取代物R98P与天然存在的氨基酸残基(脯氨酸)在这个位置相同。但这可能只是一个巧合,因为Chloroflexi中的NifD样蛋白可能不会催化氮固定。

 

为了排除这样的可能性,进行了重氮营养生长实验,为固氮作用提供直接证据。结果显示,活性>50%的变体可以支持大肠杆菌的重氮生长,而活性<30%的变体则几乎不能支持生长。随后,克隆带有R98PR98HR98N取代的NifD蛋白并在酵母中表达。与天然NifD相比,这三个变异体对蛋白酶介导的酵母线粒体降解的耐受性都有所增强。

 

为了研究R98P取代的一般适用性,构建了具有同等取代作用的A.vinelandiiR.capsulatusAnabeanaNifD蛋白,并在酵母中表达。Wester blot显示,所有与K.oxytoca R98P相当的变异体都对线粒体蛋白酶表现出了抗性。另外,由于A.vinelandiiNifD蛋白已被广泛地用于在真核线粒体,因此在大肠杆菌中测定了vinelandii NifD的等效替代(R97P)功能。结果表明,在K.oxytoca NifD中相当于R98P的替代物在线粒体活性固氮酶构建中具有普遍应用的潜力。

 

K.oxytoca MoFe蛋白的晶体结构表明,R98NifK中的D516形成氢键,这可能对稳定NifDK蛋白复合物有重要意义。为了测试NifD-R98NifK-D516之间的相互作用是否有重要性,我们构建了相互的电荷变化取代基来创建NifD-R98D/NifK-D516R的双重变体。结果发现这个电荷交换的MoFe蛋白变异体恢复了60%的活性,这足以支持大肠杆菌的重氮营养生长。结果表明,通过修饰亚基间的相互作用,合理设计或人工进化固氮酶应该是可行的。

从K.oxytoca中筛选保留固氮酶活性的R98替代品

2.K.oxytoca中筛选保留固氮酶活性的R98替代品

 

MPP由酵母中MAS1MAS2基因编码的两个亚基组成。这两种基因是在酵母中必不可少及,并且其缺失突变体是致死的。因此,我们无法确定它们是否参与了原始酵母宿主中的NifD降解。为了克服这个问题,我们决定在大肠杆菌中重构酵母MPP。重组MPP在大肠杆菌中的蛋白水解功能通过与绿色荧光蛋白(GFP)融合的特定线粒体前导序列Su9的有效裂解得以证实。随后,在重氮营养条件下,将酵母MPP表达模块与携带野生型NifD基因或其R98P衍生物的基于操纵子的nif基因簇共表达。结果表明MPP可以访问酵母线粒体中未折叠形式的NifD。从这些结果可以预期,酵母MPP与野生型固氮酶系统的共表达消除了重氮营养的生长。因此,当酵母MPP通过前导肽靶向线粒体时,它主导NifD蛋白的降解。


为了改造作物中的固氮酶,确定NifD位点98处的关键精氨酸残基是否也导致高等植物对MPP介导的蛋白酶的敏感性至关重要。在大肠杆菌中,我们采用了类似的方法重组了3种模式植物--水稻、烟草和拟南芥。三种重组植物型多肽均可在大肠杆菌中发挥功能,因为它们能有效地分离与GFP共转化的Su9引导肽。同样,以操纵子为基础的nif基因簇表达的NifD及其R98P变异体也被用来检测它们对植物型MPPs的耐受性。结果表明,它们的R98P变体抗裂解。总之,在真核生物中MPP介导的NifD蛋白质的消化很普遍,而R98P突变可以使植物线粒体中构建稳定NifD

大肠杆菌中真核MPPs的重组和Nif蛋白对MPPs稳定性的测定

3.大肠杆菌中真核MPPs的重组和Nif蛋白对MPPs稳定性的测定


结论:

植物细胞器是植物基因工程进入异源代谢途径或复杂生物系统的重要目标。我们的研究结果突出了与正确处理靶向细胞器的外源蛋白有关的问题,并指出阈下信号肽裂解位点存在于非宿主蛋白质序列中的异常处理的风险。虽然这种序列的出现可能是偶然的,信号肽裂解蛋白酶可以被认为是外源蛋白质的“门卫”。由于加工肽酶所识别的氨基酸序列具有相当大的兼并性,因此很难准确预测外源蛋白质进入细胞器后是否会被降解。我们在大肠杆菌中重组MPPs的方法提供了一个简单的生物检定法,可以在真核生物构建之前预先评估稳定性,如有必要,还可以进行定向进化,以便在线粒体中稳定表达。

 

参考文献:

M. M. Georgiadis et al., Crystallographic structure of the nitrogenase iron protein

from Azotobacter vinelandii. Science 257, 1653–1659 (1992).

L. M. Rubio, P. W. Ludden, Maturation of nitrogenase: A biochemical puzzle.

J. Bacteriol. 187, 405–414 (2005).

P. C. Dos Santos et al., Iron-sulfur cluster assembly: NifU-directed activation of the

nitrogenase Fe protein. J. Biol. Chem. 279, 19705–19711 (2004).

 

文献链接:

https://doi.org/10.1073/pnas.2002307117

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2020年6月29日,北京大学生命科学院王忆平课题组于PNAS上发表了一篇题为“Using synthetic biology to overcome barriers to stable expression of nitrogenase in eukaryotic organelles”的研究文献,该文献揭示了利用合成生物学攻克真核细胞器中稳定固氮酶表达的障碍。
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