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Front Plant Sci|华南农业大学揭示转录因子GmWRKY142通过上调镉耐受性1-like基因赋予镉抗性

Front Plant Sci|华南农业大学揭示转录因子GmWRKY142通过上调镉耐受性1-like基因赋予镉抗性

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华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的研究人员于Front Plant Sci上发表了一篇题为“Transcription Factor GmWRKY142 Confers Cadmium Resistance by Up-Regulating the Cadmium Tolerance 1-Like Genes”的研究文献,该文献揭示了转录因子GmWRKY142通过上调镉耐受性1-like基因赋予镉抗性

 文章来源

背景:镉(Cd)是一种对植物和动物均具有毒性的非必需金属微量元素,大豆是重要的油料作物,重金属污染是严重抑制大豆生长并威胁人体健康的重要因素。 由于转录因子通过控制下游基因表达而成为Cd应激反应的关键调节因子,因此转录因子(TFs)可能是Cd排毒和耐受性调节网络中的核心成分。利用Cd胁迫下大豆的mRNA全面转录组,通过qRT-PCR分析鉴定并确认了29Cd应答性WRKY基因。

 

结果:

为了进一步表征GmWRKY142,采用qRT-PCR分析组织样品并确定Cd诱导的表达模式。GmWRKY142在根、荚、种子中有更高的表达水平。为了研究Cd胁迫后GmWRKY142的表达模式,将大豆根在不同的时间段内暴露于不同的Cd浓度,观察到镉诱导的GmWRKY142的表达显著上调

表达模式分析

1. GmWRKY142的表达模式分析

 

进一步的分析以确认GmWRKY142作为典型转录因子的状态,研究了GmWRKY142的亚细胞定位,仅在细胞核中观察到了GmWRKY142-GFP融合蛋白。在酵母单杂交分析中,携带pGADT7-GmWRKY142pAbAi-Wbox载体的共转化子可以在含有150 ng/mL AbASD/-Leu板上生长。但当W-box序列突变为TAAAATTAAAAT时,酵母细胞无法生长,这与空白载体的结果相似。此外,进行了本氏烟草叶的双重荧光素酶测定。最终结果表明GmWRKY142可能转录激活下游靶基因。

蛋白序列,亚细胞定位

2. GmWRKY142蛋白的序列分析,亚细胞定位和转录活性测定

 

为了确定GmWRKY142Cd抗性中的作用,在拟南芥中进行了GmWRKY142的异位表达。在正常生长条件下,WTGmWRKY142-OE植物之间没有观察到生长发育的差异。但在Cd胁迫下,GmWRKY142-OE植物显示出更高的Cd耐受性。进一步的评估表明,GmWRKY142-OE植物的株高和鲜重显著高于野生型,而WT中的Cd含量更高。

过表达表型分析

3. GmWRKY142的过表达赋予转基因拟南芥中增强的Cd耐受性

 

为了评估GmWRKY142过表达对大豆Cd耐性的影响,使用发根农杆菌介导的转化系统产生了转基因的有毛根。在没有镉的情况下,GmWRKY142转基因和野生型毛状根之间没有发现明显差异。但在用Cd处理的转基因和对照毛状根之间观察到明显的差异。此外,转基因GmWRKY142毛状根中的Cd含量显著低于Cd处理后的WT根中,综合结果表明,GmWRKY142在拟南芥和大豆毛状根中的过表达可以增强Cd耐受性。

根中过表达分析

4. GmWRKY142的过表达赋予转基因大豆毛状根增强的Cd耐受性

 

Cd诱导了GmCDT1-1GmCDT1-2表达水平,表明这两个基因可能在Cd耐受性中起作用。为了测试GmWRKY142是否可以直接结合已鉴定的W-box,使用GmWRKY142进行了酵母单杂,并将含有原始或突变W-box元素的启动子序列片段作为诱饵。结果表明,GmWRKY142可以与包含原始W-box的选定启动子序列片段相互作用。为了确定GmWRKY142转录因子是否可以激活GmCDT1-1GmCDT1-2转录,在本氏烟草中进行了双重荧光素酶分析。结果表明GmWRKY142GmCDT1-1GmCDT1-2的转录激活因子。

启动子

5. GmWRKY142结合并激活了GmCDT1样基因的启动子

 

为了探索GdCDT1-1GmCDT1-2在镉胁迫下的功能,对转基因拟南芥和野生型植物进行了CdCl 2处理。结果表明,GmCDT1-1 OX系(OX 25)和GmCDT1-2 OX系(OX DH)均比WT表现出更高的生物量积累。对Cd胁迫下WTOX植物中Cd含量的分析表明,在WT植物的根和茎中检测到更高的Cd水平。这些结果表明,拟南芥中GmCDT1-1GmCDT1-2的过表达可以通过限制Cd的摄取来增强Cd的耐受性。

抗性分析

6. GmCDT1-1GmCDT1-2 的过表达拟南芥品系显示出对镉胁迫的耐受性

 

结论:

在本研究中,我们已经在大豆中鉴定了26GmWRKY基因上调,3个基因下调。还从大豆中克隆了新的正调控的GmWRKY142基因,并研究了其对Cd耐受性的调控机制。GmWRKY142在根中高表达,被Cd大幅上调,位于细胞核中,并表现出转录活性。GmWRKY142在细胞中的过表达拟南芥和大豆毛状根显著增强了对Cd的耐受性,并导致应激反应基因的大量转录重编程。此外,通过在拟南芥中的异源表达验证了GmCDT1-1GmCDT1-2降低Cd吸收的功能。综合结果确定GmWRKYs可以应对Cd胁迫,GmWRKY142直接靶向调节相关基因以降低Cd吸收并积极调节Cd耐受性。总之,GmWRKY142-GmCDT1-1/2级联模块可用于潜在地生产对Cd胁迫具有耐受性且可食部分Cd积累减少的大豆。

参考文献 

Dell’Aglio E, Giustini C, Kraut A, Couté Y, Costa A, Decros G, Gibon Y,Mazars C, Matringe M, Finazzi G, et al (2019) Identification of the Arabidopsis calmodulin-dependent NAD 1 kinase that sustains the elicitor-induced oxidative burst. Plant Physiol 181: 1449–1458
Bai X, Liu L, Zhang C, Ge Y, Cheng W (2011) Effect of H 2 O 2 pretreatment on Cd tolerance of different rice cultivars. Rice Sci 18: 29–35

DOI:10.1104/pp.20.00377

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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