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Horticulture Res|西北农林科技大学揭示苹果SERRATE通过调节MdMYB基因以及microRNA来负调控抗旱性

Horticulture Res|西北农林科技大学揭示苹果SERRATE通过调节MdMYB基因以及microRNA来负调控抗旱性

2020年7月1日,西北农林科技大学的研究人员于Horticulture ResearchIF:5.404)上发表了一篇题为“Apple SERRATE negatively mediates drought resistance by regulating MdMYB88 and MdMYB124 and microRNA biogenesis”的研究文献,该文献揭示了苹果SERRATE通过调节MdMYB88和MdMYB124以及microRNA来负调控抗旱性。

文章来源

背景

SERRATE是保守的真核RNA加工因子影响了mRNA的选择性剪切SE也在内含子剪切功能方面发挥作用,以促进内含子的靶向基因相关联的转录。干旱胁迫是影响苹果产量和品质的主要限制因素。ABA是一种干旱诱导的植物激素,在植物对环境胁迫的反应中起重要作用。MdMYB88和MdMYB124是苹果干旱胁迫的两个正调节剂,本研究表明MdSE通过负调控MdMYB88和MdMYB124介导的ABA稳态而参与了苹果的抗旱性。


结果

MdSE与MdMYB88和MdMYB124相互作用并降低其转录本和蛋白质水平

通过BiFC分析证实了MdSE与MdMYB88或MdMYB124之间的相互作用,并通过Co-IP分析进一步证实了该相互作用。然而酵母双杂交分析所示,MdSE与酵母中的MdMYB88不相互作用,表明MdSE与MdMYB88或MdMYB124的物理相互作用可能需要其他成分。蛋白质印迹分析表明在干旱条件下,MdSE降低了MdMYB88和MdMYB124蛋白的水平。

转录和蛋白表达水平
图1:MdSE通过与它们相互作用来降低MdMYB88和MdMYB124的转录本和蛋白质水平

MdSE亚细胞定位和表达分析

根据瞬时表达分析,YFP-MdSE融合蛋白存在于烟草细胞核中。SE 主要在花中表达,其次是茎,叶和根。所述MDSE表达水平响应于干旱胁迫。

亚细胞定位结果

图2:MdSE亚细胞定位和表达分析

MdSE是抗旱性的负调节剂

为了了解MdSE在苹果干旱反应中的生物学功能,研究了MdSE转基因植物和非转基因GL-3植物的耐旱性。结果MdSE RNAi植物具有更高的光合作用速率和水分利用效率。MdSE OE植物对干旱胁迫更为敏感。数据表明MdSE负调节苹果的抗旱性。

干旱反应表型
图3:MdSE转基因植物对干旱胁迫的反应

MdSE调节干旱条件下的气孔孔径和ABA积累

MdSE在MdNCED3转录物和ABA含量下的调控对干旱进行了研究。qRT-PCR分析,干旱诱导的MdNCED3表达在MdSE RNAi植物中明显较高,但在MdSE OE植物中则低于GL-3植物。LC-MS分析表明MdSERNAi植物含有显着更多的ABA,但MdSE OE植物对干旱的响应比GL-3植物要少MdSE RNAi植物对ABA诱导的气孔关闭高度敏感,而MdSE OE植物则不那么敏感

ABA含量
图4:MdSE RNAi和MdSE OE植物中的ABA反应和含量

MdSE富含MdNCED3启动子

研究MDSE是否通过MdNECD3影响相关联的表达水平MdNCED3启动子。ChIP-qPCR结果显示,MdNCED3处MdSE富集在MdMYB88和MdMYB124结合的同一区域中的启动子。还使用双荧光素酶法检测MdSE对MdNCED3表达的影响。结果表明,MdMYB88和MdMYB124增强MdNCED3表达。这些结果表明,MdSEMdNCED3的调节取决于其与MdMYB88和MdMYB124的关联。

活性结果

图5:MdSE富含MdNCED3启动子,并降低了MdNCED3活性

MdSE调节干旱条件下苹果中miRNA的功能

使用qPCR分析了干旱响应性miRNA的表达在干旱条件下,这些miRNA的表达水平在MdSE RNAi植物中降低,表明MdSE和SE在miRNA表达中具有相似的作用。数据表明,MdSE与SE 在miRNA表达中具有相似的功能,并通过调控干旱负责的miRNA负调控干旱。

miRNA表达

图6:MdSE影响苹果响应干旱的miRNA表达
结论

我们的研究阐明了MdSE在抗旱胁迫中的作用。MdSE通过影响miRNA的表达并负调控MdMYB88和MdMYB124的蛋白质积累,从而在抗旱性中发挥负作用,从而导致ABA积累的负调控。我们的研究提供了对MdSE应对干旱胁迫的复杂机制的更深入了解,并确定了通过分子育种改善干旱的候选基因。


参考文献
【1】Clarke, J. H., Tack, D. F., Findlay, K. M., Van Montagu, M. & Van Lijsebettens, M.The SERRATE locus controls the formation of the early juvenile leaves and phase length in Arabidopsis. Plant J. 20, 493–501 (1999).
【2】Prigge, M. J. & Wagner, D. R. The Arabidopsis SERRATE gene encodes a zinc-finger protein required fornormal shoot development. Plant Cell 13,1263–1279 (2001).
【3】Raczynska, K. D. et al. The SERRATE protein is involved in alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 42, 1224–1244 (2014).

该研究得到了国家重点研究发展计划和国家自然科学基金的支持。

论文链接:
https://doi.org/10.1038/s41438-020-0320-6
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2020年7月1日,西北农林科技大学的研究人员于Horticulture Research(IF:5.404)上发表了一篇题为“Apple SERRATE negatively mediates drought resistance by regulating MdMYB88 and MdMYB124 and microRNA biogenesis”的研究文献,该文献揭示了苹果SERRATE通过调
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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