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Plant Journal|华中农业大学利用重组自交系比较水稻种子不同发育阶段的代谢组学
Plant Journal|华中农业大学利用重组自交系比较水稻种子不同发育阶段的代谢组学
华中农业大学的研究人员于 the Plant Journal上发表了一篇题为“Comparativeanalysisofmetabolomeofriceseedsatthree developmentalstagesusingarecombinantinbredline population”的研究文献，该文献揭示了利用重组自交系群体比较水稻种子三个发育阶段的代谢组学。
背景
作为生物体生理状态的反映，代谢产物对于植物生长和植物-环境相互作用以及人类健康至关重要。植物是人类重要的食物和营养来源，但有关水稻种子代谢组在不同发育阶段的遗传和分子基础的知识仍然有限。在这里，我们对种子进行了广泛靶向的代谢分析，表征了水稻种子在不同发育阶段的代谢变化。
结果
水稻不同发育阶段的代谢谱分析
为了进一步确定MH63和ZS97种子在不同发育阶段的代谢物含量和代谢转移的多样性，在籽粒充实的成熟种子和发芽种子中对种子进行了广泛靶向的代谢谱分析。结果跨发育阶段的代谢差异更为显著，每个阶段的稻米种子都积累了高水平的不同化合物。
图1.MH 63和ZS 97之间水稻籽粒在不同发育阶段的代谢变化为了探究MH63和ZS97之间代谢变异的遗传决定因素，使用了210个RIL群体进行进一步研究。观察到成熟种子和发芽种子之间代谢产物在种子之间的动态变化，表明这三个阶段的代谢持续不断。
图2.210 RIL s不同发育阶段水稻籽粒的代谢变化
水稻种子代谢变化的mQTL鉴定
在成熟种子中检测到的1506个mQTL中，分别有1415、70和21个基因座分别占相应化合物变异的20％，20-50％和一半以上。在成熟种子和发芽种子中，总共分别获得112、91和115个mQTL，大于20％。
图3.三个阶段的mQTL的统计结果
分析mQTL的候选基因
为了鉴定MH63和ZS97种子中代谢变异的潜在候选基因，进行了基因组，转录组和代谢组学数据的分析。结果表明，LOC_Os07g04970是控制阿魏酸羟色胺生物合成的候选基因，其启动子和编码区的遗传变异可能协同影响其含量变异。进一步研究表明，LOC_Os06g03990的阻遏作用在天冬酰胺积累。MH63和ZS97之间的l-天冬酰胺含量不同可能是LOC_Os06g03990蛋白序列变异的结果。
图4.验证LOC _Os06g39990在天冬酰胺和氨基酸积累中的作用
代谢物网络及代谢物与植株表型之间的关系
为了研究受遗传变异影响的代谢物组，使用上述三个阶段的RIL群体的代谢物谱进行了一系列相关分析。尽管同一代谢物对在不同阶段的相关性值相差很大，但跨阶段也发现了保守的相关性。此外，我们还确定了不同阶段的一些保守的相关性和子网。
图5.代谢物和代谢物-植株表型关联网络结论MH 63和ZS 97之间的多样性以代谢物的含量和发育阶段的代谢转移为特征。跨三个阶段的编码代谢物的mQTL的进一步分析表明，代谢物积累的遗传调控与发育阶段密切相关。这项研究极大地提高了我们对不同阶段水稻种子代谢组变异的遗传和生化基础的了解，并为水稻育种策略提供了深刻的见识，这些策略在提高产量的同时又保持了高营养水平。参考文献
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【3】Borevitz,J.O.,Hazen,S.P.,Michael,T.P.etal.(2007)Genome-widepatterns ofsingle-featurepolymorphisminArabidopsisthaliana.Proc.NatlAcad.Sci.USA,104,12057–12062
该研究得到国家杰出青年科学基金，国家自然科学基金国家重点计划，国家自然科学基金和海南大学创业基金的支持。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.14482 下载原文
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服务简介
一、酵母单杂交
酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。
二、酵母双杂交
酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法，是在真核模式生物酵母中进行的，因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点，现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。
应用领域
植物：自交不亲和机理研究
病毒：朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选
信号通路：转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选
癌症医学：癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选
寄生虫医学：毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选
基础原理研究：肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育
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项目名称 |
内容 |
交付标准 |
服务周期 |
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酵母双杂文库构建 |
RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标 |
酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片 |
25个工作日，如需转化酵母延长15个工作日 |
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酵母双杂文库筛选 |
诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证 |
完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序 |
2个月左右 |
订购信息
文库构建流程
总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标
单/双杂筛选流程
诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理
样品要求
细胞样本：细胞数量大于1×10^7；动物样本：大于1 g；植物样本：大于2 g；总RNA：大于200 µg
筛选服务：客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒
案例分析
1）载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体，进行引物设计和测序验证。
2）自激活检测结果
pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照
pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照
实验现象结论
对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，因此不存在自激活。
结果：ABC 诱饵克隆没有自激活作用。
3）文库筛选
4）阳性克隆鉴定
筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测
编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆，编号“+”为阳性对照，编号“-”为阴性对照。
在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中，可以看到，阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长，而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因，在 SD-TL 可以正常生长，但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此，在34个初始阳性克隆中，除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长，表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。
5）回转验证
阳性克隆回转验证 His 和 Ade 报告基因检测
15 种阳性克隆在SD-TL和SD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照，标注“-”为阴性对照。
结果显示，15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 和 ADE2 报告基因；其余均能激活 HIS3 和 ADE2 报告基因。
