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Nature Plants|中国科技大学揭示分子伴侣Raf1辅助组装RuBisCO的分子机制

作者：南京瑞源生物技术有限公司 浏览： 发表时间：2020-07-12 17:00:00

Nature Plants|中国科技大学揭示分子伴侣Raf1辅助组装RuBisCO的分子机制

中国科技大学的研究人员于Nature Plants上发表了一篇题为“Molecular basis for the assembly of RuBisCO assisted by the chaperone Raf1”的研究文献，该文献揭示了分子伴侣Raf1辅助组装RuBisCO的分子机制。

文章来源

背景 

光合作用是地球上的基本生物过程，可为大多数生物提供能量和糖分。在这个过程中， RubisCO是自然界中最丰富的酶，负责大气CO转换为有机碳。RuBisCO酶通常分为三种形式，形式I是在植物，藻类等生物中最普遍的形式， RuBisCO因它的催化速度慢并不可避免地受到O2的抑制。因此，构建RuBisCO以提高羧化效率可以增加作物生长和产量。形式I RUBISCO的组成是一个复杂的过程，需要一系列伴侣。分子伴侣Raf1是最早的RuBisCO生物发生核编码的叶绿体识别蛋白，在这里我们使用结构分析与生化分析相结合，确定了RuBisCO动态组装过程的分子机理。


结果

Raf1二聚体的全长结构

研究了鱼腥藻的全长结构。结果显示其每个不对称单元由一个Raf1分子组成，该分子覆盖从Asn 16到Ile 347的残基。对称操作表明Raf1进一步组装成交换的二聚体。
晶体结构图



图1. Raf1的晶体结构存在形式

Rbcl8 Raf18配合物的整体结构

分子伴侣的复合物的结构表明，Raf1可能具有植物Raf1和BSD2的双重功能。免疫印迹分析表明Raf1 C-tail突变不影响重组RbcL的溶解度和稳定性。接下来，我们使用镍亲和纯化法纯化了含RbcL的复合物，并使用凝胶电泳评估了组装状态，使用SEC-MALS分析进一步验证。进一步证实了Raf1 C-tail在RbcL组装中的作用。结果表明，Raf1 C-tail插入RbcL的催化部位中也有助于由二聚体组装RbcL八聚物。

插入到 Rbcl 催化部位中的 Raf1对 Rbcl 八聚体组装的影响

图2. 插入到 Rbcl 催化部位中的 Raf1对 Rbcl 八聚体组装的影响

RbcL–Raf1–RbcS复合物的多个中间体的低温结构

L8F8复合物和全酶L 8 S 8之间的结构比较表明，Raf1α和RbcS结合到两个相邻RbcL二聚体之间的区域。重叠的结合区表明Raf1α和RbcS最有可能只与RbcL结合。为了阐明此纯化复合物中的相互作用模式，进一步研究，最终获得了代表不同组装中间体的复合物的四个结构， RbcL–Raf1–RbcS中间体的这些结构使我们能够在分子水平上观察RbcS对Raf1的顺序置换，这表明RuBisCO的组装过程是动态的。

低温结构图


图3. Rubisco 组装中间体的低温结构


Raf1是主要的分子伴侣，可协助RuBisCO全酶的组装

除了Raf1的，还有其它蛋白伴侣，如GroEL的-ES和RBCX，为了比较这些伴侣在RuBisCO组装过程中的作用，在大肠杆菌中共表达了带有His标签的RbcL或全酶L8S8。结果表明RbcL可以在完整的分子伴侣的协调协助下正确折叠和组装。在不存在Raf1的情况下，上清液中仅获得少量RbcL，这表明Raf1是RbcL折叠的主要伴侣。
为了进一步检测重组RuBisCO是否具有酶活性，我们用大肠杆菌的粗提物进行了活性测定。Raf1的缺失导致活性降低。数据表明，Raf1和RbcX都是RuBisCO正确组装和充分发挥活性所必需的。但是，Raf1发挥了更大的作用。

在Raf1和其它蛋白伴侣进行RuBisCO组装结果


图4. 在Raf1和其它蛋白伴侣进行RuBisCO组装结果

Raf1抑制CcmM35介导的RuBisCO的体外凝结

结构分析表明，Raf1α和SSUL1在RbcL上具有一个重叠的结合区，然而由于空间位阻，Raf1α和SSUL与RbcL同时结合是不可能的。为了检验该假设，使用在N末端融合绿色荧光蛋白（eGFP）的RbcL蛋白，比较在存在或不存在Raf1的情况下CcmM35介导的RuBisCO缩合。结果也与我们在RuBisCO组装过程中多种中间体的低温结构一致。
研究了RuBisCO缩合物是否可以在体外被Raf1溶解。结果表明Raf1的添加会触发冷凝液的逐渐分解，从而导致浊度随时间降低。添加的Raf1越多，冷凝物的溶解速度就越快。RbcS从RbcL的移位最可能是由于对CcmM35介导的RuBisCO缩合具有拮抗作用。这些实验表明，Raf1可能不仅是控制RuBisCO全酶缩合速度的调节剂，而且还是分解RuBisCO缩合物的增溶剂。
Raf1抑制CcmM35介导的RuBisCO的缩合反应图5. Raf1抑制CcmM35介导的RuBisCO的缩合反应、

结论

在这里，我们介绍了全长Raf1及其与RbcL的复合物的晶体结构，以及最终形成RuBisCO全酶的一系列组装中间体的低温结构。结构分析与生化分析相结合，使我们能够找出Raf1辅助的RuBisCO组装的分子机理。

参考文献：

【1】Bar-On, Y. M. & Milo, R. The global mass and average rate of RuBisCO. Proc.Natl Acad. Sci. USA 116, 4738–4743 (2019)

【2】Ellis, R. J. The most abundant protein in the world. Trends Biochem. Sci. 4,241–244 (1979).

【3】Bracher, A., Whitney, S. M., Hartl, F. U. & Hayer-Hartl, M. Biogenesis and metabolic maintenance of RuBisCO. Ann. Rev. Plant Biol. 68, 29–60 (2017).


该研究得到中国国家自然科学基金，中国科学院战略重点研究计划和中国科学院青年创新促进会的支持。

文献链接

https://doi.org/10.1038/s41477-020-0665-8

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