河南农业大学硕士论文|TaERFL1a转录因子在小麦响应干旱胁迫和籽粒淀粉合成中的功能研究

今天跟大家分享的是河南农业大学高天的硕士学位论文，指导老师是李鸽子博士，揭示了TaERFL1a转录因子在小麦响应干旱胁迫和籽粒淀粉合成中的功能。

摘要

本课题组前期研究发现，TaERFL1a基因的转录水平在冻胁迫小麦幼苗叶片内显著上调，推测TaERFL1a转录因子在小麦响应非生物逆境胁迫中发挥了重要功能。本研究利用大麦条纹花叶病病毒诱导的基因沉默(barley stripe mosaic virus-virus induced gene-silencing， BSMV-VIGS)技术，探究了TaERFL1a基因在小麦响应干旱胁迫和籽粒淀粉合成中的功能， 并通过酵母双杂交文库筛选，鉴定了TaERFL1a转录因子的互作蛋白。

结果

TaERFL1a基因的克隆和结构

本研究中以基因表达序列标签EST序列为模板，在NCBI同源比对，得到TaERFL1a基因参考序列，该序列与EST序列的同源性高达96.1％。TaERFL1a转录因子与具有相似结构的ERFs的氨基酸序列对比发现，这些ERF转录因子具有AP2／ERF典型的保守结构域。进化树分析表明，TaERFL1a的AP2／ERF保守域与AtERF4和LeERF3具有91．4％的同源性。

图1.EST序列与TaERFL1a基因序列比对

图2. TaERFL1a氨基酸同源比对(A)和进化树分析(B)

TaERFL1a转录因子的亚细胞定位研究

序列分析显示，TaERFL1a具有转录因子典型的核定位特征。为了进一步证明这一序列分析结果，本研究将重组载体pCAMBIAl300-TaERFLla-GFP和对照pCAMBIAl300-GFP。通过农杆菌介导的烟草瞬时表达系统，把35S驱动下的重组和对照质粒分别浸染烟草叶片，结果显示，TaERFL1a-GFP仅在细胞核有荧光信号发现，表明TaERFL1a是一个核定位蛋白。

图3. TaERFL1a蛋白的亚细胞定位

TaERFL1a在小麦响应干旱胁迫中的功能

进一步对接种BSMV-VIGS-TaERFL1a且有病毒表型的小麦幼苗植株，运用qPCR进行定量分析染病植株TaERFL1a基因的转录水平，结果表明，接种BSMV-VIGS-TaERFL1a植株中TaERFL1a基因表达水平比对照植株降低，表明本研究已获得了TaERFL1a基因沉默植株。将TaERFL1a基因沉默植株和对照植株分别用含有20％PEG6000的Hoagland完全营养液进行模拟干旱胁迫处理，结果表明在胁迫处理3 d时TaERFL1a基因在沉默植株仍被显著抑制。

图4.TaERFL1a沉默片段扩增(A)和BSMVα/β/TaERFL1a/GFP质粒线性化及产生病毒检测(B)

图5. 接种BSMV-GFP和TaERFL1a后8天小麦幼苗的表型(A)和TaERFL1a基因表达水平(B和C)

TaERFLla在小麦籽粒淀粉合成中的功能

将上述产生的BSMV-VIGS-TaERFL1a和BSMV-VIGS-GFP两种病毒分别接种在即将开花的小麦穗部。qPCR检测了接种后穗部有病毒表型的籽粒中TaERFL1a基因的表达量，测定结果显示接种BSMV-VIGSTaERFL1a植株的籽粒在病毒接种后TaERFL1a的表达量均显著降低。表明接种BSMV-VIGS-TaERFL1a病毒的小麦植株籽粒内TaERFL1a基因的表达被显著抑制。

图6.接种病毒后23天穗部表型(A)及TaERFL1a基因表达分析（B和C）

小麦灌浆期是小麦籽粒淀粉合成的关键时期,与接种BSMV-GFP的植株相比，接种TaERFL1a的小麦植株的穗部表型没有显著的变化。定量测定结果表明，BSMV-VIGS-TaERFL1a成熟籽粒的粒长和粒宽均显著低于BSMV-VIGS-GFP籽粒，淀粉含量与干粒重量显著降低。

图7. 不同时期的穗部及籽粒表型

图8.成熟籽粒的长和宽

TaERFL1a转录因子互作蛋白的筛选

将重组诱饵载体转化至酵母Y2H Gold感受态，将检测正确的单菌落扩繁至OD600=0．5， 梯度稀释后涂布含有不同浓度梯度的AbA的SD／-Trp固体培养基，确定合适的AbA浓度。结果表明，TaERFL1a转录因子能激活MEL1的表达，具有转录激活活性。

图9.转化pGBKT7-TaERFL1a转录因子的Y2H Gold在不同浓度AbA平板生长状况(A)以及TaERFL1a的转录活性检测（B）

qPCR方法定量检测了上述TaERFL1a互作蛋白基因在小麦植株遭受冷、盐和水分胁迫等非生物逆境胁迫后的表达水平，结果表明，同TaERFLla相似，这些互作基因均受冷、盐和水分胁迫等非生物逆境胁迫的诱导。

图10.互作蛋白基因在冷、盐和水平胁迫3 d后(A)及在TaERFL1a基因沉默植株叶片内的转录水平(B)

对TaERFL1a和TaSGT1之间以及TaERFL1a和TaDAD2之间的互作关系进行验证。结果表明蛋白间发生了互作，激活了AUR1-C，ADE2和HIS3报告基因的表达，从而验证了TaERFL1a转录因子能分别和TaSGT1和TaDAD2在酵母体内产生互作。

图11.酵母中TaERFL1a和TaSGT1及TaERFL1a和TaDAD2的互作

如果TaERFL1a转录因子能与TaSGT1或TaDAD2互作，那么TaSGT1和TaDAD2应该也定位在细胞核内。为了验证这一猜测，再次进行了亚细胞定位，结果表明，TaSGT1和TaDAD2蛋白在细胞核和细胞膜均有绿色荧光信号，表明TaSGT1和TaDAD2均定位在细胞核和细胞膜上。

采用BiFC试验进一步验证了TaERFL1a和TaSGT1及TaERFL1a和TaDAD2的互作关系，结果表明，转录因子TaERFL1a分别与TaSGT1和TaDAD2蛋白在植物细胞核内均存在互作。

图12. TaSGT1和TaDAD2的亚细胞定位

图13. BiFC试验验证TaERFL1a和TaSGT1及TaERFL1a和TaDAD2的互作关系

结论

本研究从小麦中辨析出一个新的ERF转录因子，采用BSMV-VIGS技术发现它在小麦的干旱胁迫与淀粉合成中发挥了重要功能，进而采用酵母双杂技术和荧光双分子互补 (BiFC)技术，揭示了转录因子能与TaERFLla与TaSGTI和TaDAD2蛋白互作。

该研究受到国家自然科学基金和国家重点研发计划、河南省科技创新杰出青年和河南省高校科技创新人才支持计划的资助。

参考文献

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