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Front Microbiol |Hsp40蛋白LeDnaJ07通过与LetrpE相互作用增强香菇的耐热性并调节IAA生物合成

Front Microbiol |Hsp40蛋白LeDnaJ07通过与LetrpE相互作用增强香菇的耐热性并调节IAA生物合成

华中农业大学的研究人员于Front Microbiol上发表了一篇题为“Hsp40 Protein LeDnaJ07 Enhances the Thermotolerance of Lentinula edodes and Regulates IAA Biosynthesis by Interacting LetrpE”的研究文献,该文献揭示了Hsp40蛋白LeDnaJ07通过与LetrpE相互作用增强香菇的耐热性并调节IAA生物合成。

文章来源

背景

香菇是一种用于汤剂,香精和替代药物的蘑菇,已在世界范围内广泛种植。Hsp40是Hsp家族的重要成员,在调节生物体的生长和发育过程以及它们对非生物和生物胁迫的抗性中起着关键作用。先前的研究发现LeDnaJ07 RNAi降低了香菇对热激和霉菌感染的抵抗力。在这项研究中,LeDnaJ07基因的结构和功能通过农杆菌介导的转化方法,通过基因克隆和过量表达在香菇应激敏感菌株YS55中进行了分析。


结果

不同香菇菌株LeDnaJ07 CDS的分析

利用PCR测序结果分析了耐热菌株S606,应力敏感菌株YS55和培养菌株WX-1之间LeDnaJ07的CDS差异。结果表明LeDnaJ07不同香菇菌株中的蛋白质相同,LeDnaJ07可以在翻译起始中起重要作用。

 LeDnaJ07序列分析 

图1. LeDnaJ07序列分析

LeDnaJ07过表达菌株的构建

用过表达载体pCAMBIA1300-g-mo表达融合蛋白mRFP- LeDnaJ07,并将该过表达载体中的抗性基因作为选择标记。Southern印迹表明在过表达菌株LeDnaJ07-mo-1和LeDnaJ07-mo-9中发现了插入片段,但在WT菌株中没有,表明包括LeDnaJ07基因在内的插入片段的整合进入香菇基因组。为了验证引入基因的表达水平,检测了在MYG培养基上生长的三个单转化体的菌丝体荧光,发现了红色荧光的清晰分布。这些结果表明成功获得了LeDnaJ07过表达重组体。


 LeDnaJ07过表达转化子的载体图谱和鉴定


图2. LeDnaJ07过表达转化子的载体图谱和鉴定

 mCherry在LeDnaJ07过表达转化子,对照转基因和WT菌株中的表达

图3. mCherry在LeDnaJ07过表达转化子,对照转基因和WT菌株中的表达

LeDnaJ07的过表达增强了香菇的菌丝生长

在MYG培养基中,两个过表达转化子(LeDnaJ07-mo-1和LeDnaJ07-mo-9)的菌落直径显著大于对照和野生型菌株,表明改善LeDnaJ07的表达可以促进MYG培养基中香菇菌丝体的生长。

影响LeDnaJ07上的过度生长香菇菌丝体

图4.影响LeDnaJ07上的过度生长香菇菌丝体

LeDnaJ07的过表达有利于香菇的耐热性

通过比较野生型,对照和LeDnaJ07过表达转化株之间热应激后的菌落直径,估算了LeDnaJ07对香菇的耐热性的影响。长期和短期热应激试验的相似结果表明,LeDnaJ07可以响应热应激而促进香菇菌丝体的恢复能力和耐热性。

热应激后LeDnaJ07的过表达促进细胞内IAA的生物合成

在25°C下,YS55,Le-m-1和两个LeDnaJ07过表达菌株的细胞内IAA浓度显示出细微差异,但在热激后它们显示出显著差异,结果表明LeDnaJ07在热激反应期间对IAA生物合成有益。

 LeDnaJ07的过表达增强热应激后香菇的耐热性和IAA生物合成

图5. LeDnaJ07的过表达增强热应激后香菇的耐热性和IAA生物合成

LeDnaJ07和LetrpE在酵母和烟叶细胞中的相互作用

在Y2H分析中,在30°C下培养3天后,所有混合物中的酵母均在SD/-Trp-Leu平板上生长。结果表明LeDnaJ07和LetrpE之间发生了弱相互作用。此外, BiFC分析显示阳性对照和测试组显示绿色荧光,但在阴性组中未观察到绿色荧光。这些数据加在一起证明了LeDnaJ07与LetrpE有相互作用。

 LeDnaJ07与LetrpE的互作验证





图6.在带有SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-Ura的板上的Y2H系统中,LeDnaJ07与LetrpE的互作验证

 LeDnaJ07与LetrpE的互作验证

图7.在带有SD/-Leu-Trp-His和SD/-Leu-Trp以及不同浓度的3AT的板上的Y2H系统中,LeDnaJ07与LetrpE的互作验证

 LeDnaJ07与LetrpE在植物细胞中的相互作用

图8. LetrpE与LeDnaJ07在植物细胞中的相互作用

结论

总之,我们克隆并分析了LeDnaJ07基因在香菇耐热菌株S606和应力敏感型株YS55与对照转基因和WT菌株进行对比,YS55中LeDnaJ07的过表达增强了转基因菌株对热胁迫的耐受性,转基因菌株中的菌丝体生长和细胞内IAA浓度明显增加。此外,本研究首次显示LeDnaJ07与LetrpE相互作用。构建了LeDnaJ07和IAA信号通路在增强香菇耐热性中的作用的模型。该研究为抗逆性蘑菇育种中DnaJ蛋白的相对表达水平提供了有价值的信息。进一步的研究将集中在LeDnaJ07 通过IAA信号途径调节香菇耐热性的机制上。

该研究受到国家自然科学基金的资助。

文献链接

 https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00707

下载原文

参考文献

【1】       Bekhochir, D., Shimada, S., Yamagami, A., Kanda, S., Ogawa, K., Nakazawa, M., et al. (2013). A novel mitochondrial DnaJ/Hsp40 family protein BIL2 promotes plant growth and resistance against environmental stress in brassinosteroid signaling. Planta 237, 1509–1525. doi: 10.1007/s00425-013-1859-3

【2】     Cao, X. T., Bian, Y. B., Xiao, X. J., and Wang, G. Z. (2015). Effect of heat stress on Lentinula edodes mycelial growth recovery and resistance to Trichoderma harzianumActa Edulis Fungi 22, 81–85.

【3】     Caplan, A. J., Tsai, J., Casey, P. J., and Douglas, M. G. (1992). Farnesylation of YDJ1p is required for function at elevated growth temperatures in Saccharomyces cerevisiaeJ. Biol. Chem. 267, 18890–18895.

 

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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