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PNAS|多方面的维管形成层细胞功能分析揭示了老银杏树的长寿机制

PNAS|多方面的维管形成层细胞功能分析揭示了老银杏树的长寿机制

北京林业大学林金星团队和扬州大学银杏研究团队与PNASIF:9.58)上发表了一篇题为“Multifeature analyses of vascular cambial cells reveal longevity mechanisms in old Ginkgo biloba trees”的研究文献,该文献揭示了银杏古树长寿的内在机制。

文章来源

背景

衰老是多细胞生物的普遍特性。尽管某些树种可以生存数百年或几千年,但其寿命所依据的分子和代谢机制尚不清楚。为了解决这个问题,我们研究银杏中维管形成层的细胞功能分析与树木年龄的相关变化。


结果

形成层细胞的径向生长模式和解剖学变化

通常,木本植物随着成熟和变老而呈现出形态上的变化。取34棵不同年龄的雌性树木的年轮核心,并使用树木年代学方法分析了年轮。这些树木的直径(DBHs)为11.5450 cm,并且环的宽度随着年龄的增长而变薄。尽管如此,但我们无法仅凭环的宽度来评估与年龄有关的增长下降的趋势。因此,进一步计算了基础面积增量(BAI),发现茎BAI在老树上仍保持较高的水平。

不同年龄的银杏树的表型分析

1. 不同年龄的银杏树的表型分析

不同树龄银杏的形态和DBH

2.不同树龄银杏的形态和DBH

为了确定维管形成层的结构是否随年龄变化,我们比较了三组形成区的解剖结构。发现树龄到200岁时,形成区的细胞层数才开始减少,然后从200岁至600岁时略有减少。

 

参与形成的植物激素和相关基因的年龄变化

为了评估维管形成层中这些相关的生理和生化参数与年龄相关的变化,确定了不同年龄的形成层细胞中植物激素的水平。随着年龄增长的IAA浓度下降,而脱落酸(ABA浓度上升。

银杏形成层的结构和生理分析

3. 银杏形成层的结构和生理分析

 

细胞分裂和分化发生在形成层区域,对维管组织的生长很重要。因此,研究了与形成层中的细胞分裂和扩张相关的基因。在这些DEG中,大多数在老树中显示出明显较低的转录水平。此外,几种与细胞分化有关的基因的转录水平也呈下调。而与细胞分裂,扩增和分化相关的基因表达几乎没有差异。

不同年龄树木形成层与细胞分裂,细胞扩增和植物激素信号传导相关的基因表达变化

4. 不同年龄树木形成层与细胞分裂,细胞扩增和植物激素信号传导相关的基因表达变化

 

为了验证RNA-seq数据,使用与RNA-seq相同的样品通过qRT-PCR验证了11个基因的表达。与ABA信号相关的Gb_19071的表达在老树中明显较高。细胞分裂相关基因Gb_11201334岁的树木中较高,并且随着年龄的增长而降低,而另外两个细胞分裂相关基因Gb_10623Gb_01998表达则呈现不规则的变化。Gb_20590生长素反应家族蛋白,从幼树到老树急剧下降,同样,与CTK信号相关的Gb_07568的表达也随着年龄的增长而降低。

与细胞分裂、IAA信号转导、qRT-PCR自噬相关基因的转录水平

5.与细胞分裂、IAA信号转导、qRT-PCR自噬相关基因的转录水平

miR166/165–HD-ZIP III相互作用参与了形成层的分化

为了筛选与维管形成层活性有关的miRNA,对不同年龄银杏的sRNA文库进行了测序。大多数miR166家族成员的表达随树龄增长显著增加,在老树中被下调。结果表明miR166/165–HD-ZIP III相互作用可能与老树木质部形成减少有关。

对miR166/165及其目标进行网络和热图分析

6.miR166/165及其目标进行网络和热图分析

老银杏树中衰老相关基因和miRNAs表达的变化

为了解决老树是否进入衰老阶段,我们分析了形成层中与衰老相关的转录因子(TF)的水平。构建了拟南芥和银杏之间的这些TFWRKYNACMYB)的系统发育树。为验证这些TF是否可能调节银杏的衰老,确定了叶片衰老过程中TF的转录水平。这些TF的转录水平在叶片衰老过程中有规律地增加或降低,表明这些TF是可能与银杏的衰老调控有关。

老树缺乏衰老症状

7.老树缺乏衰老症状

进一步研究发现,绝大部分与衰老相关的TF的表达都没有显示衰老趋势。尽管大多数miR172家族成员的表达没有明确的模式,但其在老树中均以高水平表达。自噬与健康和长寿有关,在银杏形成层中,表达了35个自噬相关基因。在三个年龄段中,这些基因均显示出相似的转录水平。对三个衰老相关基因的qRT-PCR验证证实,它们的转录水平不会随年龄而变化。以上所有结果表明,老树不具有衰老特性。

叶片衰老过程中与衰老相关的 TFs 的转录水平

8.叶片衰老过程中与衰老相关的 TFs 的转录水平

形成层诱导防御相关基因的表达

接下来,分析了LRR类植物抗性基因的数量和表达水平,发现457 LRR类的R基因在形成层中表达。这表明老树保留了诱导抗性的关键成分的表达。选择了三个与防御相关的基因用于qRT-PCR验证。三组中的R基因的转录水平相似。

防御相关基因在不同年龄树木中的表达

9.防御相关基因在不同年龄树木中的表达

先形成的抗性相关基因在形成层中的表达

PCBER是木质部的主要蛋白质成分,通过还原酚类二聚体以产生抗氧化剂分子来提供保护。银杏是一种几乎没有进行基因功能分析的物种,研究整个生物合成途径中的转录变化可能会为银杏衰老过程中的变化提供更可靠的依据。首先研究了木质素单体的生物合成途径,研究表明,老树中合成途径基因的表达水平并不低于新树。没有证据说明表达会随着衰老而强烈下降。

黄酮类化合物是植物次生代谢产物的主要物质,可以防御生物和非生物胁迫。研究发现,老树形成层中的类黄酮生物合成相关基因的表达水平没有比新树低。

衰老与生长之间的平衡示意图

10. 衰老与生长之间的平衡示意图

 

结论

研究结果发现银杏树长寿并非某单一的长寿基因调控,而是生长于衰老过程中多种因素综合平衡的结果。该研究成果对揭示树木在个体水平上的生长于衰老调控机制具有重要科学意义。

该研究受到国家自然科学基金和高等学校学科创新引智计划的支持。

参考文献

1S. Munné-Bosch, Ageing in perennials. Crit. Rev. Plant Sci. 26, 123–138 (2007).

2H. Thomas, Senescence, ageing and death of the whole plant. New Phytol. 197, 696–711(2013).

3J.-H. Schippers, Transcriptional networks in leaf senescence. Curr. Opin. Plant Biol. 27,77–83 (2015)

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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