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Horticulture Res| 西南大学通过亚细胞定位等技术揭示CsWAKL08通过调控ROS和JA信号传导的机制正向调节柑橘CBC抗性

Horticulture Res| 西南大学通过亚细胞定位等技术揭示CsWAKL08通过调控ROSJA信号传导的机制正向调节柑橘CBC抗性

西南大学中国农业科学院柑橘研究所的研究人员于Horticulture Research上发表了一篇题为“CsWAKL08, a pathogen-induced wall-associated receptor-like kinase in sweet orange, confers resistance to citrus bacterial canker via ROS control and JA signaling”的研究文献,该文献揭示了一种病原体诱导的柑橘中与壁相关的受体样激酶CsWAKL08,通过ROS控制和JA信号转导赋予柑橘溃疡病抗性。

文章来源

背景

柑橘溃疡病(CBC)对柑橘生产构成了严重威胁。WAKL是在抵抗多种真菌和细菌性疾病中起主要作用的蛋白质。然而,尚不清楚WAKL在抵抗CBC中的作用。在此研究了赋予CBC抗性的CsWAKL08的作用,并分析了CsWAKL08介导的CBC抗性的分子机制。研究发现植物激素水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)也可以诱导CsWAKL08,并跨越质膜。与对照植物相比,过表达CsWAKL08的植物中的过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增强,从而在转基因植物中介导了活性氧(ROS)稳态。


结果

柑橘中CsWAKL的鉴定和生物信息学分析

使用MEGA V7.2构建了21CsWAKL的系统发育树,每个CsWAKL具有N末端GUB-WAK结构域和C末端激酶结构域,在这21个完整的CsWAKL中检测到15个保守的基序。


CsWAKL08是可能受Xcc影响的CBC抗性基因

研究了这21CsWAKL的表达,为了确定CsWAKLCBC之间的关系,通过qRT-PCRCBC敏感品种和抗CBC的品种之间测定了感染后CsWAKL的表达。结果发现在抗性品种中,CsWAKL01CsWAKL08表达连续上调。而敏感品种中表达没有明显变化,因此这两个CsWAKL基因可以代表Xcc抗性基因。而CsWAKL20表现出与之相反的表达谱,因此该基因可能与Xcc敏感性有关。1. CsWAKL家族的全基因组注释和Xcc诱导的表达谱


CsWAKL08编码WAKL

使用从敏感品种叶片样品中分离的RNA获得了CsWAKL08的完整转录序列。CsWAKL08是由位于C. sinensis 9号染色体上的基因编码的715个残基的WAKLORF可能编码功能蛋白。其包含一个短内含子和一个1358 bp的内含子,C端结构域包含Ser/Thr激酶结构域,为激酶活性的中心。该蛋白还包含一个预测跨膜(TM)结构,介于 aa 312- 335之间,由外显子23编码。


CsWAKL08SAMeJA诱导

植物激素通常调节植物疾病相关的蛋白质的表达,为了研究CsWAKL08在抗病相关信号中的作用,对两个品种植株进行了ABAMeJASA处理,并通过qRT-PCR分析了CsWAKL08的表达。结果表明,在抗CBC的植种中,MeJASA均可诱导CsWAKL08的表达,而在敏感株中,CsWAKL08的表达程度较低。这些发现表明CsWAKL08在一些与疾病抗性相关的信号传导途径中起作用。

CsWAKL08的生物信息学和表达特征

2. CsWAKL08的生物信息学和表达特征


CsWAKL08定位于质膜

CsWAKL08亚细胞定位进行了分析,在瞬时表达重组pLGNe-CsWAKL08-GFP质粒中研究CsWAKL08在细胞内的定位。结果CsWAKL08-GFP在质膜中非常明显,因此,预测分析和瞬时表达都清楚地表明CsWAKL08是一种细胞膜定位蛋白,可以在细胞外信号接收中发挥作用。

CsWAKL08定位于质膜

3. CsWAKL08定位于质膜


CsWAKL08的过表达赋予CBC

使用过表达CsWAKL08的转基因柑橘构建体进一步阐明CsWAKL08的作用,并进一步研究其在Xcc抗性中的作用。构建了由CaMV 35S启动子驱动的GUS编码序列的CsWAKL08过表达载体。通过PCR在三株转基因植物(OE1-OE3)中检测到一个片段,该片段在用空载体转化的对照植物(CK)中不存在,并且在叶圆片边缘上有明显的蓝色GUS染色。qRT-PCR进一步证实这三种过表达植物表达高水平的CsWAKL08。为了研究这些转基因植物的CBC抗性,进行了下一步研究。通过渗透法进一步评估了转基因植物的抗性。结果表明,CsWAKL08的过表达可以强烈增强转基因柑橘中对Xcc的抗性。

CsWAKL08过表达植物中Xcc反应的评估

4. CsWAKL08过表达植物中Xcc反应的评估


CsWAKL08沉默赋予CBC敏感性

为了进一步评估CsWAKL08在敏感型植株中的重要性,通过RNA干扰敲低了CsWAKL08。为了验证所得的转基因植物,进行了PCR,通过GUS染色对这五株植物进行验证。qRT-PCR证实这五株植物表现出相对较低的CsWAKL08表达。数据表明柑橘中CsWAKL08的沉默增加了对Xcc的敏感性。CsWAKL08突变体表现出CBC敏感性增强,这表明CsWAKL08对于CBC抗性很重要。

CsWAKL08沉默的植物中Xcc反应的评估

5. CsWAKL08沉默的植物中Xcc反应的评估


CsWAKL08参与抗氧化剂系统以重建ROS稳态作为Xcc感染的防御反应

植物抗性反应常常取决于ROS诱导的对病原体或植物细胞凋亡性的氧化损伤。为了确定ROS稳态是否参与CsWAKL08介导的Xcc抗性,分析了CK和转基因植物中的相对ROS水平。结果发现在具有Xcc抗性的植株中,H2O2水平高于CK植物中的水平,而O2-较低。高水平的H2O2可能在Xcc感染过程中引起超敏反应。在Xcc敏感性的植株中,ROS浓度与过表达植物的ROS浓度相反。这些结果证实了ROS水平与Xcc耐药性之间潜在联系。

植物具有抗氧化酶,包括过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD。由于ROS是可诱导并受CsWAKL08严格调控,因此研究了抗氧化酶的表达。发现PODSOD活性均被CsWAKL08过表达上调,并被CsWAKL08沉默抑制。因此过表达CsWAKL08的细胞抗性水平的提高与活性更高的酶系统控制的ROS稳态存在联系。

CsWAKL08调节转基因植物中的ROS稳态

6. CsWAKL08调节转基因植物中的ROS稳态


CsWAKL08积极调节JA积累

植物激素包括SAJA,在免疫信号网络中发挥关键作用。研究了转基因植物和CK植物中SAJA的含量。此外,分别研究了参与JASA的生物合成的CsAOSCsICS基因的转录水平。与CK相比,转基因植物的JA含量显著较高,在Xcc感染后显著上调,CsWAKL08的过表达或沉默均未显著诱导SA含量。结果表明CsWAKL08可能通过调节JA的生物合成在JA的积累中起作用。

CsWAKL08积极调节转基因植物中的JA生物合成

7.CsWAKL08积极调节转基因植物中的JA生物合成


CsWAKL08调节对Xcc感染的JA依赖性信号传导

CsWAKL08可能通过调控JA依赖性信号传导来调控Xcc感染。为了验证研究了这些转基因植物中某些JA反应基因的表达。LOX1MPK3是在植物抗性中有作用,已被证实参与JA依赖性信号PR蛋白。结果表明,CsLOX1分别在CsWAKL08过表达和沉默植物中上调和下调,而CsMPK3类似。结果表明CsWAKL08在抗性中起作用,证实了CsWAKL08可以通过调节JA依赖性信号激活JA响应来调节Xcc感染,从而赋予CBC抗性和耐受性。

CsWAKL08积极调节转基因植物中JA反应基因的表达

8. CsWAKL08积极调节转基因植物中JA反应基因的表达


结论

根据研究结果得出结论,CsWAKL08通过调控ROSJA信号传导的机制正向调节CBC抵抗力。这些结果进一步突出了该激酶家族在植物病原体抗性中的重要性。

该研究受到国家重点基础研发计划,中央高校基本科研基金,广西科技重点项目和国家现代农业产业技术体系建设项目的支持。

参考文献

1Krattinger, S. G. & Keller, B. Molecular genetics and evolution of disease

resistance in cereals. N. Phytol. 212, 320–332 (2016).

2Yang, P. et al. Fungal resistance mediated by maize wall-associated kinase

ZmWAK-RLK1 correlates with reduced benzoxazinoid content. N. Phytol. 221,

976–987 (2019).

3Hurni, S. et al. The maize disease resistance gene Htn1 against northern corn

leaf blight encodes a wall-associated receptor-like kinase. Proc. Natl Acad. Sci.

USA 112, 8780–8785 (2015).

文献链接

https://doi.org/10.1038/s41438-020-0263-y

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柑橘溃疡病(CBC)对柑橘生产构成了严重威胁。WAKL是在抵抗多种真菌和细菌性疾病中起主要作用的蛋白质。然而,尚不清楚WAKL在抵抗CBC中的作用。在此研究了赋予CBC抗性的CsWAKL08的作用,并分析了CsWAKL08介导的CBC抗性的分子机制。研究发现植物激素水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)也可以诱导CsWAKL08,并跨越质膜。与对照植物相比,过表达CsWAKL08的植物中的过氧化物
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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