Plant Biotechnology Journal|通过酵母单杂文库筛选和亚细胞定位揭示菊花CmHSFA4基因正调控转基因菊花的盐胁迫耐受性

南京农业大学园艺学院的研究人员于Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Chrysanthemum CmHSFA4 gene positively regulates salt stress tolerance in transgenic chrysanthemum”的研究文献，该文献揭示了菊花CmHSFA4基因正调控转基因菊花的盐胁迫耐受性。

背景

土壤盐渍化影响植物的生长，还会导致高水平的活性氧（ROS）积累。植物细胞利用抗氧化机制防御ROS的损害。HSF是细胞应激的重要调节剂，HSFA4还具有耐盐性。HSFA4的功能可增强胁迫响应转录本的表达，并调节胁迫下植物ROS的稳态。但是HSFA4基团的功能尚不为人知。菊花是一种主要的商业观赏植物，很容易受到盐分胁迫，导致叶绿化并严重危害植物的健康。在这里，我们从菊花中分离了CmHSFA4基因，通过过表达菊花的CmHSFA4调节离子和ROS稳态来调节耐盐性。

结果

CmHSFA4序列特征

Cmhsfa4基因序列由1242-bp 和编码358个氨基酸的1074-bp ORF组成。 它在N端包含一个保守的HSF-DBD结构域，在C端包含一个挥发性AHA结构域，以及一个中间的HR-A/B区域。 系统发育分析表明，CmHSFA4与其他已知的HSFA4a具有较高的相似性。

图1. CmHSFA4和其他HSF蛋白序列

CmHSFA4定位于细胞核

为了确认CmHSFA4的定位，将由35S启动子驱动的CmHSFA4-GFP融合体引入到洋葱表皮细胞中。GFP信号主要在pMDC43-CmHSFA4-GFP转化的细胞核中检测到。对于用阳性对照pMDC43-GFP转化的细胞，GFP在整个细胞中表达。

图2. CmHSFA的亚细胞定位

CmHSFA4可以激活转录并与HSE结合

阳性对照pCL1-pGBKT和pGBKT7-CmHSFA4构建体的酵母在SD/-His-Ade培养基上生长良好，在添加x-α-gal的SD/-His-Ade培养基上呈蓝色，而阴性对照pGBKT7无法在培养基上生长。结果表明CmHSFA4是转录激活因子，而AHA基序对其转录活性有重要作用。

图3. CmHSFA 4的反式激活分析和DNA结合测定

盐分诱导的CmHSFA4表达

在盐分胁迫条件下，CmHSFA4的转录本表达水平被诱导为对照的3.5倍，并且显著高于对照，这表明CmHSFA4可能参与了响应植物的盐分胁迫。

图4. PCR揭示盐度处理下菊花植物中CmHSFA 4的表达

CmHSFA4过表达增强了菊花的耐盐性

在盐度处理下，OXm H4和H5 中CmHSFA4的表达水平大大高于野生型植物。与野生菊花植物相比，过表达CmHSFA4的植物H4和H5表现出更少的胁迫破坏。结果表明过表达CmHSFA4菊花的增强了耐盐性。

图5.CmHSFA 4过表达增强了菊花的耐盐性

盐胁迫下CmHSFA4过表达抑制叶绿素含量下降

在正常生长条件下，OX系H4和H5中的叶绿素含量几乎与野生型植物中的相当。在盐处理后，OX系和WT植物中的总叶绿素含量均下降。表明CmHSFA4的过表达保护叶绿素免受盐分胁迫的降解。

图6. 盐处理下生长的野生型和CmHSFA 4过表达植物中叶绿素含量

CmHSFA4过表达平衡了离子稳态并改变了盐分胁迫相关基因的表达

为了评估CmHSFA4的过表达对离子稳态的影响，将转基因植物和野生型植物进行盐处理。在非胁迫条件下，转基因植物和野生型植物之间的Na⁺和K⁺含量几乎没有变化。在盐胁迫条件下，转基因植物的Na⁺含量显著低于野生植物。K⁺含量高于野生植物。同时，离子平衡相关基因的转录水平比WT高得多。

图7. Na⁺和K⁺在野生型以及在盐处理下生长的CmHSFA 4的转基因过表达中的含量

CmHSFA4过表达降低ROS水平并激活ROS清除酶活性

将WT和转基因叶片分别用DAB和NBT染色。与野生型植物相比，CmHSFA4过表达叶片中染色强度明显降低，反映出低水平的H₂O₂和O₂^-积累。在正常生长条件下，H4和H5植物H₂O₂水平与野生型相当，在盐处理下，H4和H5植物O₂^-含量一直在增加。

图8.盐度胁迫的野生型和CmHSFA 4转基因品系的ROS含量及染色

为了进一步阐明CmHSFA4在ROS稳态中的作用，研究了ROS清除酶的活性，发现在盐处理后，OX植物中的SOD，APX，CAT比WT高，通过实时PCR分析了ROS稳态相关基因的表达水平，在非胁迫条件下，观察到WT和OX植物之间的微小差异。盐胁迫下，在WT和OX植物中均被上调，并且OX植物中的表达水平始终高于WT。

图9. 野生型和CmHSFA 4转基因品系中的ROS清除酶活性及相关基因表达

结论

菊花的耐盐性对于实现稳定和可持续的生产至关重要。研究结果表明 CmHSFA4赋予菊花耐盐性，其增强菊花对盐分的耐受性是离子稳态的结果，CmHSFA4通过调节ROS稳态来增强菊花对盐分的耐受性。这项研究为今后改良菊花耐盐品种奠定了基础。

该研究受到国家自然科学基金、中央高校基础研究基金、国家杰出青年科学基金和公益性农业科学研究专项基金的支持。

参考文献

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文献链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.12871

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