南京农业大学园艺学院的研究人员于Plant Biotechnology Journal上发表了一篇题为“Chrysanthemum CmHSFA4 gene positively regulates salt stress tolerance in transgenic chrysanthemum”的研究文献,该文献揭示了菊花CmHSFA4基因正调控转基因菊花的盐胁迫耐受性。
背景
土壤盐渍化影响植物的生长,还会导致高水平的活性氧(ROS)积累。植物细胞利用抗氧化机制防御ROS的损害。HSF是细胞应激的重要调节剂,HSFA4还具有耐盐性。HSFA4的功能可增强胁迫响应转录本的表达,并调节胁迫下植物ROS的稳态。但是HSFA4基团的功能尚不为人知。菊花是一种主要的商业观赏植物,很容易受到盐分胁迫,导致叶绿化并严重危害植物的健康。在这里,我们从菊花中分离了CmHSFA4基因,通过过表达菊花的CmHSFA4调节离子和ROS稳态来调节耐盐性。
结果
CmHSFA4序列特征
Cmhsfa4基因序列由1242-bp 和编码358个氨基酸的1074-bp ORF组成。 它在N端包含一个保守的HSF-DBD结构域,在C端包含一个挥发性AHA结构域,以及一个中间的HR-A/B区域。 系统发育分析表明,CmHSFA4与其他已知的HSFA4a具有较高的相似性。
图1. CmHSFA4和其他HSF蛋白序列
CmHSFA4定位于细胞核
为了确认CmHSFA4的定位,将由35S启动子驱动的CmHSFA4-GFP融合体引入到洋葱表皮细胞中。GFP信号主要在pMDC43-CmHSFA4-GFP转化的细胞核中检测到。对于用阳性对照pMDC43-GFP转化的细胞,GFP在整个细胞中表达。
图2. CmHSFA的亚细胞定位
CmHSFA4可以激活转录并与HSE结合
阳性对照pCL1-pGBKT和pGBKT7-CmHSFA4构建体的酵母在SD/-His-Ade培养基上生长良好,在添加x-α-gal的SD/-His-Ade培养基上呈蓝色,而阴性对照pGBKT7无法在培养基上生长。结果表明CmHSFA4是转录激活因子,而AHA基序对其转录活性有重要作用。
图3. CmHSFA 4的反式激活分析和DNA结合测定
盐分诱导的CmHSFA4表达
在盐分胁迫条件下,CmHSFA4的转录本表达水平被诱导为对照的3.5倍,并且显著高于对照,这表明CmHSFA4可能参与了响应植物的盐分胁迫。
图4. PCR揭示盐度处理下菊花植物中CmHSFA 4的表达
CmHSFA4过表达增强了菊花的耐盐性
在盐度处理下,OXm H4和H5 中CmHSFA4的表达水平大大高于野生型植物。与野生菊花植物相比,过表达CmHSFA4的植物H4和H5表现出更少的胁迫破坏。结果表明过表达CmHSFA4菊花的增强了耐盐性。
图5.CmHSFA 4过表达增强了菊花的耐盐性
盐胁迫下CmHSFA4过表达抑制叶绿素含量下降
在正常生长条件下,OX系H4和H5中的叶绿素含量几乎与野生型植物中的相当。在盐处理后,OX系和WT植物中的总叶绿素含量均下降。表明CmHSFA4的过表达保护叶绿素免受盐分胁迫的降解。
图6. 盐处理下生长的野生型和CmHSFA 4过表达植物中叶绿素含量
CmHSFA4过表达平衡了离子稳态并改变了盐分胁迫相关基因的表达
为了评估CmHSFA4的过表达对离子稳态的影响,将转基因植物和野生型植物进行盐处理。在非胁迫条件下,转基因植物和野生型植物之间的Na+和K+含量几乎没有变化。在盐胁迫条件下,转基因植物的Na+含量显著低于野生植物。K+含量高于野生植物。同时,离子平衡相关基因的转录水平比WT高得多。
图7. Na+和K+在野生型以及在盐处理下生长的CmHSFA 4的转基因过表达中的含量
CmHSFA4过表达降低ROS水平并激活ROS清除酶活性
将WT和转基因叶片分别用DAB和NBT染色。与野生型植物相比,CmHSFA4过表达叶片中染色强度明显降低,反映出低水平的H2O2和O2-积累。在正常生长条件下,H4和H5植物H2O2水平与野生型相当,在盐处理下,H4和H5植物O2-含量一直在增加。
图8.盐度胁迫的野生型和CmHSFA 4转基因品系的ROS含量及染色
为了进一步阐明CmHSFA4在ROS稳态中的作用,研究了ROS清除酶的活性,发现在盐处理后,OX植物中的SOD,APX,CAT比WT高,通过实时PCR分析了ROS稳态相关基因的表达水平,在非胁迫条件下,观察到WT和OX植物之间的微小差异。盐胁迫下,在WT和OX植物中均被上调,并且OX植物中的表达水平始终高于WT。
图9. 野生型和CmHSFA 4转基因品系中的ROS清除酶活性及相关基因表达
结论
菊花的耐盐性对于实现稳定和可持续的生产至关重要。研究结果表明 CmHSFA4赋予菊花耐盐性,其增强菊花对盐分的耐受性是离子稳态的结果,CmHSFA4通过调节ROS稳态来增强菊花对盐分的耐受性。这项研究为今后改良菊花耐盐品种奠定了基础。
该研究受到国家自然科学基金、中央高校基础研究基金、国家杰出青年科学基金和公益性农业科学研究专项基金的支持。
参考文献
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文献链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.12871