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J. Exp. Bot.| 中国农业大学通过酵母单杂、亚细胞定位和VIGS等技术揭示GhNAC83通过调节ABA信号转导和生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除

J. Exp. Bot.| 中国农业大学通过酵母单杂、亚细胞定位和VIGS等技术揭示GhNAC83通过调节ABA信号转导和生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除

中国农业大学的研究人员于J. Exp. Bot.上发表了一篇题为“GhNAC83 inhibits corm dormancy release by regulating ABA signaling and CK biosynthesis in Gladiolus hybridus.”的研究文献,该文献揭示了GhNAC83通过调节ABA信号转导和对照生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除。

文章来源

背景

球茎休眠是唐菖蒲等许多种球花育种的重要性状。唐菖蒲球茎是经过改良的地下茎,具有储藏器官的功能,可以在不利的环境条件下生存。本文研究了唐菖蒲球茎休眠解除的机理。通过对 CDR的转录分析,我们确定了一个重要的脱落酸(ABA)信号调节因子GhPP2C1。通过酵母单杂交筛选,发现 GhNAC83直接调控了GhPP2C1的表达。


结果

GhPP2C1促进唐菖蒲球茎休眠的解除

为了研究唐菖蒲发芽的分子机制,研究了唐菖蒲不同时期的发芽情况并进行转录组测序。在转基因过程中,植物激素生物合成(玉米素和脱落酸)和激素转导高度丰富,支持了这些激素在球茎休眠解除中的作用。

唐菖蒲球茎休眠释放的转录组分析

1.唐菖蒲球茎休眠释放的转录组分析

ABA和细胞分裂素参与球茎休眠释放

2. ABA和细胞分裂素参与球茎休眠释放

PP2C是核心ABA信号转导模块的一部分,参与种子休眠。为了研究PP2CCDR中的功能,在转录组中鉴定了其154个成员。在开花植物的不同器官中评估了GhPP2C1的表达,观察到在几乎所有器官中均表达。进一步结果表明GhPP2C1可以调节CDR。使用VIGS方法研究了GhPP2C1CDR中的作用, 结果表明在休眠球茎中GhPP2C1的下调导致CDR延迟,表明GhPP2C1充当了CDR的正调节剂。

GhPP2C1基因在唐菖蒲中的表达模式

3.GhPP2C1基因在唐菖蒲中的表达模式

GhPP2C1参与球茎休眠的解除

4.GhPP2C1参与球茎休眠的解除

GhNAC83GhPP2C1的负调节剂

为了进一步探索CDR期间GhPP2C1的调控,我们通过Hi-TAIL PCR 分离了翻译起始位点上游的GhPP2C1调控区的1.5 kb序列。基于顺式元素的分布,截短了启动子,并在烟草叶片中进行了瞬时表达分析。结果表明,当删除区域I(–1285–833),启动子活性不受影响;但是,II区的缺失(–833–615)导致启动子活性急剧下降。

GhNAC83结合GhPP2C1启动子并抑制其转录

5. GhNAC83结合GhPP2C1启动子并抑制其转录

为了鉴定结合GhPP2C1启动子该区域的TF,使用来自拟南芥属的TF文库进行了酵母单杂交筛选。考虑到CDR中的表达水平和从酵母单杂交筛选中鉴定出的克隆数,选择了GhNAC83GlaUn057212)用于进一步研究。GhNAC83结合天然的GhPP2C1启动子,但不能结合突变型启动子。此外,为了进一步测试GhNAC83GhPP2C1转录的影响,进行了瞬时反式激活分析。GhNAC83显著抑制了GhPP2C1 的表达。进一步分析以确定植物体内GhNAC83 GhPP2C1启动子的调节。结果表明,GhNAC83降低了GhPP2C1启动子的活性。GhNAC83直接结合GhPP2C1启动子,并负面调节其在植物中的表达。


GhNAC83 在球茎休眠释放期间被下调

为了更好地了解GhNAC83的功能,分析了其序列和表达模式。转录组数据显示,GhNAC83CDR中被下调的10GhNAC之一。GlaUn078410显示出与GhNAC83相似的趋势,并且与拟南芥中的ATAF1和水稻中的OsNAC6具有高度的序列相似性。已证明ATAF1OsNAC6参与ABA信号传导。结果证明在植物中GhNAC83负调节GhPP2C1 CDR

为了研究GhNAC83在转录调控中的潜在作用,研究了GhNAC83在细胞中的亚细胞定位。结果表明,GhNAC83-GFP融合蛋白定位于细胞核。另外,在酵母中进行反式激活活性测定以研究GhNAC83的反式激活能力。数据表明,GhNAC83在其C末端区域的氨基酸161219之间包含一个反式激活结构域。结果表明GhNAC83是一种双功能TF

GhNAC83的表达模式和蛋白质特性

6. GhNAC83的表达模式和蛋白质特性

沉默 GhNAC83 加速球茎休眠释放

为了研究GhNAC83在唐菖蒲中的潜在作用,进行了VIGS研究。结果当GhNAC83沉默时,加速了种子发芽。为了证实GhNAC83基因沉默对GhPP2C1基因转录的影响,测定了GhPP2C1基因在GhNAC83基因沉默株系中的表达水平。 结果表明,GhPP2C1 GhNAC83沉默系中表达量较高。结合测定结果,数据表明GhNAC83负调控 GhPP2C1 表达并抑制CDR

沉默GhNAC83可加速球茎休眠释放

7. 沉默GhNAC83可加速球茎休眠释放

GhNAC83通过直接靶向GhNAC83启动子介导CK生物合成

为了进一步研究GhPP2C1GhNAC83如何影响CDR,测定了GhNAC83沉默植株中内源性植物激素水平。与TRV2植株相比,GhNAC83沉默植株只有一半的ABA含量,并且玉米素水平显著增加。该结果表明,GhNAC83可能在CDR期间参与ABACK之间的拮抗作用。GhNAC83可能在不依赖于GhPP2C1的情况下介导玉米素的生物合成。对ABA来说,沉默GhNAC83会降低ABI5下游基因的表达,而沉默GhPP2C1则相反。总体而言,这些结果表明,GhNAC83可以通过GhPP2C1影响ABA信号传导反应,并且GhNAC83ABA和玉米素水平有拮抗作用。

GhNAC83以GhPP2C1独立介导CK的生物合成

8. GhNAC83GhPP2C1独立介导CK的生物合成

为了研究CK生物合成基因GhCYP735AGhIPTCDR中的作用,采用了VIGS 结果表明,抑制 GhCYP735AGhIPT基因的导致发芽延迟。沉默植株花蕾和根明显短于TRV2对照。 此外,CDR标记 GhdUTPase的表达显著低于TRV2。结果表明沉默CK生物合成基因降低了植株中CK含量并进一步抑制了CDR

细胞分裂素生物合成基因的沉默延迟了球茎休眠的释放

9. 细胞分裂素生物合成基因的沉默延迟了球茎休眠的释放

为了确定GhNAC83是否可以直接调节CK生物合成基因的表达,我们通过Hi-TAIL PCR 克隆了一个1594 bpGhIPT上游序列。使用酵母单杂交法发现GhNAC83结合GhIPT启动子的T2片段,而T2片段中NAC结合位点的突变导致其没有结合能力。进行了LUC以分析GhNAC83 在植物中对GhIPT表达的调节。与35SGhNAC83GhIPTLUC共转化的本生烟草叶细胞的活性明显低于用空载体和GhIPTLUC转化的细胞。数据表明,GhNAC83负调控植物体内的GhIPT。总之,结果表明,GhNAC83直接结合GhIPT启动子,在CK生物合成负调节GhPP2C1

GhNAC83对唐菖蒲球茎休眠解除的调控

10. GhNAC83对唐菖蒲球茎休眠解除的调控

结论

在这项研究中,我们在唐菖蒲中确定了一个新的NAC成员GhNAC83,并分析其在CDR的负调节作用。这些发现表明,GhNAC83通过调节ABACK通路,从而控制球茎休眠。我们的发现揭示了GhNAC83在调节植物休眠中调控ABACK途径中的作用。

该研究受到国家自然科学基金的支持。


参考文献

1Ashikari M, Sakakibara H, Lin S, et al. 2005. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science 309, 741-745.

2Bolger AM, Lohse M, Usadel B. 2014. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics, btu170. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.

3Bozhkov PV, Lebedenko LA, Shiryaeva GA. 1992. A pronounced synergistic effect of abscisic acid and 6-benzyladenine on Norway spruce (Picea abies L. Karst) somatic embryo maturation. Plant Cell Reports 11, 386-389.

文献链接

https://doi.org/10.1093/jxb/ery428

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球茎休眠是唐菖蒲等许多种球花育种的重要性状。唐菖蒲球茎是经过改良的地下茎,具有储藏器官的功能,可以在不利的环境条件下生存。本文研究了唐菖蒲球茎休眠解除的机理。通过对 CDR的转录分析,我们确定了一个重要的脱落酸(ABA)信号调节因子GhPP2C1。通过酵母单杂交筛选,发现 GhNAC83直接调控了GhPP2C1的表达。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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