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Plant Physiology|高CO2/低氧应答转录因子DkERF24和DkWRKY1相互作用并激活DkPDC2启动子

Plant Physiology|高CO2/低氧应答转录因子DkERF24和DkWRKY1相互作用并激活DkPDC2启动子

浙江大学农业与生物技术学院的殷学仁教授课题组于Plant Physiology上发表了一篇题为“High-CO2/Hypoxia-Responsive Transcription Factors DkERF24 and DkWRKY1 Interact and Activate DkPDC2 Promoter”的研究文献,该文献揭示了高CO2/低氧响应转录因子DkERF24DkWRKY1相互作用并激活DkPDC2启动子。

文章来源

背景

缺氧反应转录因子的鉴定和功能表征对于理解植物对自然厌氧环境以及新鲜农产品的储存和运输过程中的反应非常重要。柿是研究缺氧反应的理想材料,转录因子(TFs)在植物对缺氧的反应中起重要作用。在这项研究中,使用柿子丙酮酸脱羧酶(DkPDC2)启动子筛选酵母单杂交文库,鉴定出三个乙烯反应因子(ERF)基因和四个WRKY转录因子基因响应于高CO2和低氧环境。酵母双杂交和双分子荧光互补分析证实了DkERF24DkWRKY1之间的蛋白质相互作用。

结果

通过酵母单杂交文库筛选鉴定和靶向缺氧反应DkPDC2启动子的TF

酵母单杂分析产生的结果与文库筛选得出的结果相似,为了验证相互作用并更精确地定位参与结合的顺式元件,进行了EMSA实验。结果表明DkERFs可以物理结合到GCC -box结构,而DkWRKYs靶向DkPDC2启动子的W -box结构。双荧光素酶测定表明DkERF23DkERF24DkERF25DkWRKY1DkWRKY7DkPDC2的转录启动子具有明显的激活作用,而DkWRKY5DkWRKY6DkPDC2启动子没有显著影响。

DkERFS和DkWRKY对DkPDC2启动子的作用

图1. DkERFS和DkWRKY对DkPDC2启动子的作用

不同柿子品种在高CO2处理下TFs的表达

选择了三个不同品种,通过RT-qPCR分析了七个TF的表达,除DkWRKY6外,所有三个品种的TF对高CO2处理都有响应。表达分析表明,DkERF25和DkWRKY5仅在高CO2下上调,而在缺氧处理中没有。DkERF23,DkERF24和DkWRKY1对高CO2和缺氧都有反应。与高CO2处理相比,缺氧处理对DkWRKY1的表达影响明显较弱。

DkERFS和DkWRKY在高CO2处理中的表达

图2. DkERFS和DkWRKY在高CO2处理中的表达

TF的亚细胞定位分析

在本氏烟草叶中进行亚细胞定位测定,以观察七个TF的亚细胞位置。DkERF23,DkERF25,DkWRKY1,DkWRKY5,DkWRKY6和DkWRKY7在细胞核中均发出强信号,而DkERF24在细胞核和细胞膜中均显示信号。

DkERFs-GFP和DkWRKYs-GFP的亚细胞定位

                                          图3. DkERFs-GFP和DkWRKYs-GFP的亚细胞定位


DkERF24和DkWRKY1对DkPDC2启动子转录的协同作用以及蛋白质-蛋白质相互作用的分析

通过双荧光素酶分析了TF的不同组合对DkPDC2启动子的影响。在各种TF之间发现了一些组合效应,DkERF24DkWRKY1之间存在较强相互作用。DkPDC2启动子表现出显著的协同激活。Y2H分析表明,DkERF24DkWRKY1之间的相互作用是唯一的直接蛋白-蛋白相互作用。还通过BiFC分析验证了DkERF24DkWRKY1之间的相互作用。BiFC结果显示阴性组合未产生可检测的荧光信号,而阳性组合以及DkERF24-YFPN/DkWRKY1-YFPCDkERF24-YFPC的共表达DkWRKY1-YFPN显示了位于细胞核中的强信号。

 DkERF24和DkWRKY1对DkPDC2启动子转录的影响及其蛋白质相互作用分析

图4. DkERF24和DkWRKY1对DkPDC2启动子转录的影响及其蛋白质相互作用分析

柿子的毒理分析

用水果盘片进行毒理分析,验证柿子脱涩过程中TFs的作用。空载体和TFs处理的果实中可溶性蛋白含量在培养过程中均有下降。同时分析了TFs与 DkPDC2基因的相互作用,结果表明,毒素能显著上调柿果盘内源性DkPDC2基因的转录,支持了缺氧反应基因与DkPDC2基因启动子相互作用。在 DkPDC2转录中DkERF24和DkWRKY1的联合作用比任何一个TF单独作用有更明显的上调。

柿子中TFs的毒理作用

图5.柿子中TFs的毒理作用

AtERF1和AtWRKY53也激活DkPDC2启动子

研究了拟南芥和柿子ERFWRKY作用下低氧反应的可能机制。通过双荧光素酶分析,AtERF1AtWRKY53显示了显著的转录激活。而AtWRKY41DkPDC2启动子的转录激活无明显影响。酵母单杂试验发现,AtERF1AtWRKY53都能与DkPDC2启动子结合。AtERF1AtWRKY53组合对DkPDC2启动子的活化程度高于两组单独活化,BIFC分析表明,AtERF1-YFPN/AtWRKY53-YFPCAtERF1-YFPC/AtWRKY53-YFPN的共表达在细胞核中也发出强信号,证实AtERF1AtWRKY53之间存在蛋白相互作用。

DkERF24和DkWRKY1对DkPDC2启动子的调控作用

图6. DkERF24和DkWRKY1对DkPDC2启动子的调控作用

结论

利用双荧光素酶法、EMSAY2H法BIFC法筛选Y1H文库,并进行进一步的研究,确定了多个新的低氧应答TFs。毒理分析证实了这种复合物在柿子果实脱涩中的作用,这对柿子产业至关重要。

该研究得到国家重点研究开发计划、国家自然科学基金、浙江省自然科学基金、霍英东教育基金会、中央大学基础研究基金和111个项目的支持。

参考文献

1Ali S, Khan AS, Malik AU, Shahid M (2016) Effect of controlled atmosphere storage on pericarp browning, bioactive compounds and antioxidant enzymes of litchi fruits. Food Chem 206: 18–29

2Banti V, Mafessoni F, Loreti E, Alpi A, Perata P (2010) The heat-inducible transcription factor HsfA2 enhances anoxia tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol 152: 1471–1483

3Bekele EA, Alis ARR, Hertog MLATM, Nicolai BM, Geeraerd AH (2016) Dynamics of metabolic adaptation during initiation of controlled atmosphere storage of ‘Jonagold’ apple: Effects of storage gas concentrations and conditioning. Postharvest Biol Technol 117: 9–20

文献链接 

http://www.plantphysiol.org/content/180/1/621


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