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Plant Physiology|中科院植物所研究人员揭示了OsPIL14–SLR1整合光信号和赤霉素信号微调盐胁迫下幼苗生长

Plant Physiology|中科院植物所研究人员揭示了OsPIL14–SLR1整合光信号和赤霉素信号微调盐胁迫下幼苗生长

中科院植物所研究人员于Plant Physiology(IF:6.9)发表了一篇题为 PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR-LIKE14 and SLENDER RICE1 interaction controls seedling growth under salt的研究文献,该文献揭示了OsPIL14–SLR1转录模块整合光信号和赤霉素信号来微调盐胁迫下幼苗生长的机制,增强了对作物如何适应盐碱环境的理解

文章来源

背景

土壤中的幼苗早期发育和出苗是植物生长的关键和作物生产的重要环节,受植物激素等内部因素和光、盐等外部因素的控制。然而,光和盐信号是如何与内源信号结合在一起控制植物生理过程的,目前还知之甚少。在这里,我们发现水稻光敏色素相互作用因子LIKE14(OsPIL14)的过度表达,或DELLA蛋白纤细RICE1(SLR1)功能的丧失,促进了中胚轴和根系的生长,特别是在黑暗和盐胁迫下。此外,盐诱导OsPIL14的转化,但增加了SLR1的积累。OsPIL14直接与细胞伸长相关基因的启动子结合并调节其表达。SLR1与OsPIL14发生物理相互作用并负性调节其功能。


结果

OsPIL14促进幼苗在黑暗中生长

为了研究OsPIL基因,我们在转基因水稻品系过表达OsPIL11,OsPIL12,OsPIL14,OsPIL15和OsPIL16,与绿色荧光蛋白(GFP)融合,并由粳稻ZH11中的OsUBQ5启动子(UBQp:OsPIL-GFP)驱动。结果显示在UBQp:OsPIL14-GFP的过表达比其他OsPIL基因的过表达导致更长的中间胚轴。我们还使用CRISPR基因组编辑来生成OsPIL14突变,导致OsPIL14的第二个外显子缺失了375 bp的片段,导致95219位氨基酸被截短,OsPIL14突变体不会产生异常的中胚轴,但在黑暗中的根比ZH11稍长。在光下生长时,它与ZH11没有区别,这些观察结果表明,OsPIL14和其他OsPIL在黑暗中促进了拟态形成和根系生长。与模拟对照相比,在培养基中添加生物活性GA3(100 µM)可以显着促进野生型和OsPIL14突变体幼苗的中胚轴,胚芽鞘和根生长,并诱导OsPIL14OE幼苗的胚轴和胚芽鞘长度。但是,GA3并未进一步诱导OsPIL14OE品系的初级根生长。

图1:OsPIL14的过度表达促进了黑暗中胚轴和根的生长

图1:OsPIL14的过度表达促进了黑暗中胚轴和根的生长。


OsPIL14的过表达增强了盐胁迫下的幼苗生长

OsPIL14OE品系在0.2M NaCl盐胁迫下,添加盐会显着抑制胚芽鞘,中胚轴和根的生长,尤其是0.2M NaCl OsPIL14OE株系的芽和根更长。盐会大大抑制OsPIL14OE系的中胚轴伸长,而在另外100µM GA3的存在下,程度会稍低一些。当用0.1M NaCl和120μM多效唑处理植物时,OsPIL14和OsPIL14OE的胚芽鞘和根伸长以及OsPIL14OE的胚轴伸长均比仅用0.1M NaCl处理的抑制作用大。这些结果表明,在盐胁迫下,OsPIL14的过表达增强了植物的生长。我们将发芽的种子放入盆中,用1或3cm的土壤覆盖,然后用75mM NaCl或水灌溉,当种子用1cm的土壤覆盖时,无论NaCl处理如何,OsPIL14OE植物的芽生长与ZH11都没有差异。但是,当种子被3cm的土壤覆盖时,70%的OsPIL14OE幼苗但50%的ZH11幼苗从土壤中出来。此外,在75 mM NaCl条件下,可能会出现40%的OsPIL14OE,而所ZH11都无法穿透土壤。这些结果表明,OsPIL1盐胁迫下促进幼苗黄化和从土壤中萌发。

图2:OsPIL14OE系对盐介导的幼苗生长抑制具有耐受性

图2:OsPIL14OE系对盐介导的幼苗生长抑制具有耐受性


盐促进OsPIL14降解

RT-qPCR表明,0.3M NaCl显著增加暗生长ZH11幼苗中OsPIL14的表达,然而与模拟对照相比,在盐处理12小时后,使用抗GFP抗体的OsPIL14 GFP水平显著降低。此外,随着NaCl浓度的增加,OsPIL14-GFP水平逐渐降低。

在NaCl处理幼苗的暗到光转换过程中,OsPIL14在茎中的表达在6h时增加并达到峰值,而OsPIL14在根部的表达在处理3h后迅速达到峰值,随后下降。当OsPIL14OE幼苗从黑暗转移到光明时,OsPIL14-GFP的水平迅速降低,并通过添加NaCl处理而进一步降低,这表明光诱导了OsPIL14的降解,类似于拟南芥中的PIF蛋白

外源GA3和PAC以及NaCl对OsPIL14积累的影响。PAC处理可降低OsPIL14-GFP水平,GA3处理可提高OsPIL14-GFP水平。 OsPIL14-GFP在PAC和NaCl均存在下进一步降低,而NaCl拮抗GA3的作用。这些结果证实,GA促进OsPIL14积累,而盐则可能通过26S蛋白酶体途径诱导OsPIL14降解。

图3:盐促进OsPIL14降解

图3:盐促进OsPIL14降解


盐诱导SLR1积累

SLR1是水稻中唯一的DELLA蛋白。0.3M NaCl处理3小时后,ZH11幼苗的SLR1转录水平略有降低。在ZH11中,通过NaCl处理,SLR1蛋白水平略有增加。尽管SLR1在100μM GA3处理下大量降解,NaCl可以部分抑制GA3诱导的SLR1降解。此外,SLR1水平随着NaCl浓度的增加而增加。此外,当幼苗移入添加0.3m NaCl的培养基中时,SLR1在NaCl处理24小时后积累并达到峰值。这些结果表明盐促进了SLR1的积累,对GA诱导的SLR1降解有轻微的抑制作用。

图4:盐促进SLR1的积累

图4:盐促进SLR1的积累


OsPIL14与SLR1进行交互

酵母双杂交试验表明,与GAL4激活域融合的OsPIL14与SLR1的GAL4 DNA结合域融合相互作用。在pull-down测定中,抗GST抗体在与GST标签的OsPIL14而非单独与GST一起孵育时,将与麦芽糖结合蛋白融合的重组SLR1下拉. 双分子荧光互补分析,发现与黄色荧光蛋白(OsPIL14-nYFP)的N端一半融合的OsPIL14和与C端YFP(SLR1-cYFP)融合的SLR共转化产生了核定位的YFP烟草叶片中的信号. 在共同免疫沉淀测定中,将35S:SLR1-HA-cYFP构建体与35S:OsPIL14-Myc-nYFP共同渗入本氏烟草中。用抗HA抗体免疫沉淀后,在共表达SLR1-HA-cYFP的样品中拉低OsPIL14-Myc-nYFP融合蛋白。这些结果共同证实了OsPIL14和SLR1之间的直接相互作用。

图5:OsPIL14直接与SLR1交互

图5:OsPIL14直接与SLR1交互

 

OsPIL14调节细胞伸长相关基因的表达,而SLR1干扰OsPIL14的活性

我们将ZH11和OsPIL14OE植物在黑暗中生长了7天,并使用RNA测序分析了全局转录组的变化。发现918个基因上调,而818个基因在OsPIL14OE和ZH11植物中下调在上调的基因中,我们选取了参与细胞伸长的扩张蛋白A4(OsEXPA4)和可能参与纤维素合成的Os08g25710进行进一步分析酵母单杂交试验表明,OsPIL14与B42激活域融合(AD-OsPIL14)可结合并激活OsEXPA4和Os08g25710启动子片段驱动的LacZ报告者的表达。此外,电泳迁移率偏移分析(EMSA)显示,GST-OsPIL14(而非GST)与含有生物素标记的G盒的OsEXPA4片段结合,并且通过添加重组MBP-SLR1减少了移位带的数量,提示SLR1抑制了OsPIL14与靶点的结合能力。进行了染色质免疫沉淀和定量PCR分析,发现OsEXPA4和Os08g25710的启动子区域在OsPIL14OE样品中显著富集,与ZH11相比;这种富集在用NaCl处理的OsPIL14OE植物中显著降低。这些结果表明OsPIL14直接调节细胞伸长相关基因的表达,并且SLR1干扰OsPIL14活性

图6:OsPIL14调节下游基因表达,SLR1抑制OsPIL14活性

图6:OsPIL14调节下游基因表达,SLR1抑制OsPIL14活性


结论

研究揭示了OsPIL14-SLR1转录模块通过整合光和GA信号来控制盐胁迫环境下幼苗生长的机制。 这种调节机制可以帮助植物将内源性和外部因素联系起来,从而在不断变化的环境中重塑生长和适应性。 过量的盐影响全球土地总面积的6%,过量的盐会损害植物的生长和发育并阻碍农业生产。 在植物的早期发育阶段,成功的芽伸长和穿透土壤对于植物生长至关重要,特别是在盐渍土壤中。 我们的发现表明,过表达OsPIL14可以促进中胚轴伸长和幼苗从土壤中的出苗,为提高耐盐性提供了合适的目标基因和作物遗传修饰策略。


参考文献

1:Achard, P., Cheng, H., De Grauwe, L., Decat, J., Schoutteten, H., Moritz, T., Van Der Straeten, D., Peng, J., and Harberd, N.P. (2006). Integration of plant responses to environmentally activated phytohormonal signals. Science 311: 91-94. 

2:Bai, M.Y., Shang, J.X., Oh, E., Fan, M., Bai, Y., Zentella, R., Sun, T.P., and Wang, Z.Y. (2012). Brassinosteroid, gibberellin and phytochrome impinge on a common transcription module in Arabidopsis. Nat. Cell Biol. 14: 810-817. 

3:Castillon, A., Shen, H., and Huq, E. (2007). Phytochrome Interacting Factors: central players in phytochrome-mediated light signaling networks. Trends Plant Sci. 12: 514-521.


原文链接:http://www.plantphysiol.org/content/early/2020/06/24/pp.20.00024

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土壤中的幼苗早期发育和出苗是植物生长的关键和作物生产的重要环节,受植物激素等内部因素和光、盐等外部因素的控制。然而,光和盐信号是如何与内源信号结合在一起控制植物生理过程的,目前还知之甚少。在这里,我们发现水稻光敏色素相互作用因子LIKE14(OsPIL14)的过度表达,或DELLA蛋白纤细RICE1(SLR1)功能的丧失,促进了中胚轴和根系的生长,特别是在黑暗和盐胁迫下。此外,盐诱导OsPIL14
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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