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New Phytologist|SAPK10-bZIP72-AOC通路介导脱落酸和茉莉酸协同抑制水稻种子萌发

   近日,中国水稻研究所种子发育课题组在New Phytologist在线发表了题为“Abscisic acid promotes jasmonic acid biosynthesis via a 'SAPK10-bZIP72-AOC' pathway to synergistically inhibit seed germination in riceOryza sativa”的研究论文,该研究首次揭示了SAPK10-bZIP72-AOC通路介导激素脱落酸和茉莉酸协同抑制水稻种子萌发的分子机制。


背景

脱落酸和茉莉酸都能抑制种子萌发,但在这一过程中它们之间的相互作用仍不清楚。在这里,我们报道了一个‘SAPK10bZIP72-AOC’途径的鉴定,ABA通过这个途径促进JA的生物合成,从而协同抑制水稻种子萌发。通过生物化学相互作用和磷酸化分析,我们发现SAPK10在177丝氨酸上具有一定的自磷酸化活性,使其主要在71丝氨酸上磷酸化bZIP72。SAPK10依赖的磷酸化增强了bZIP72蛋白的稳定性,增强了DNA与AOC启动子G-box顺式元件的结合能力,从而提高了AOC的转录水平和JA的内源性浓度。阻断JA生物合成显著减轻了ABA对种子萌发的敏感性,表明ABA的抑制作用部分依赖于JA浓度的升高。

 

结果

SAPK10在丝氨酸177上自动磷酸化

SAPK10是拟南芥中OST1和蚕豆中AAPK最接近的同源基因,据报道SAPK10是ABA诱导的水稻SnRK2型激酶,是ABA信号传导的核心成分。SAPK10的序列相似性分析确定了两个假定的磷酸化位点,丝氨酸177和苏氨酸178,它们与拟南芥中的OST1保守。SAPK10的自磷酸化分析表明,磷酸标记检测到纯化的GST-SAPK10的磷酸化带,在CIAP处理后消失,而作为阴性对照的GST没有磷酸化,说明SAPK10自身具有自磷酸化活性。

图1:SAPK10在丝氨酸177上自动磷酸化

图1:SAPK10在丝氨酸177上自动磷酸化


SAPK10的过表达赋予水稻对ABA的超敏性

通过构建SAPK10高表达系(OxSAPK10)和CRISPR/Cas9介导的敲除突变体(crsapk10)来分析SAPK10在水稻中的生物学作用。产生SAPK10S177A过表达系(OxSAPK10S177A)以探索SAPK10的自磷酸化对其自身生物学功能的影响。选择具有与OxSAPK10-3相似的SAPK10转录水平的OxSAPK10S177A-2和OxSAPK10S177A-3进行表型分型。有趣的是,与OxSAPK10-3的延迟种子萌发和幼苗生长相近,OxSAPK10S177A株系对ABA失去了过敏性,其发芽率和幼苗生长与野生型相似。因此,这些结果表明,阻断自磷酸化位点会损害SAPK10在ABA信号传导中的功能,并抑制种子萌发。

图2:过表达SAPK10使水稻对脱落酸(ABA)过敏


SAPK10磷酸化并稳定bZIP72

通过无细胞蛋白降解实验来检测SAPK10介导的磷酸化对bZIP7稳定性的影响。用ABA处理的幼苗显著延长GSTbZIP72的半衰期至10分钟,而GST-bZIP72在使用模拟蛋白提取物时仅在6分钟内降解到一半,表明ABA提高了bZIP72的蛋白质稳定性另一方面,通过使用GST-bZIP72S71D作为底物,其中Ser71被天冬氨酸取代以模拟bZIP72的构成性磷酸化状态,我们发现模拟磷酸化显著稳定了蛋白质,当与模拟总蛋白提取物孵育时,半衰期为9分钟,添加26S蛋白酶体抑制剂MG132显著延缓了GST-bZIP72的体外降解,这意味着该蛋白质处于泛素/26S蛋白酶体途径的降解下结果强烈表明,ABA和SAPK10介导的Ser71磷酸化增强了bZIP72的稳定性。

“图3:SAPK10磷酸化并稳定bZIP72”

图3:SAPK10磷酸化并稳定bZIP72


bZIP72和TRAB1在ABA信号转导中冗余作用

SAPK10和bZIP72之间的激酶-底物关系促使我们研究bZIP72在ABA中的作用。选择bZIP72转录水平与OxbZIP72相当的OXBZIP71A-15和OxbZIP72S71A17进行表型分型。然而,OxbZIP72S71A失去了对ABA的超敏性,恢复了种子发芽率和幼苗生长表明SAPK10介导的丝氨酸71磷酸化是开启ABA信号传导中bZIP72功能的关键开关

“图4在日本晴中,bZIP72和TRAB1在脱落酸(ABA)信号中起冗余作用”

图4:在日本晴中,bZIP72和TRAB1在脱落酸(ABA)信号中起冗余作用


磷酸化bZIP72通过与启动子中的G盒结合直接激活AOC转录

由于赤霉素和JA积极参与种子萌发,我们检测了OxbZIP72和WT萌发胚中一些关键GA或JA途径基因的转录水平,实验证明AOC积极参与ABA介导的种子萌发和萌发后生长过程的可能性。此外,我们测试了GST-bZIP72对一些具有G-box基序的水稻GA途径基因的启动子的结合能力,发现GST-bZIP72能够与GA20ox2的启动子结合,这表明bZIP72参与了GA的体内稳态。

图5:磷酸化bZIP72通过与启动子中的G盒结合直接激活AOC转录

图5:磷酸化bZIP72通过与启动子中的G盒结合直接激活AOC转录


ABA通过诱导JA积累部分抑制种子萌发

SAPK10-bZIP72-AOC调控途径暗示了ABA和JA在种子萌发过程中相互作用的一个积极的调节途径。为了解决这个问题,外源ABA被应用到WT的发芽种子中。当WT发芽胚被ABA处理时,JA的积累水平显著提高。与此结果一致的是,一组ABA信号基因和JA通路基因,包括AOC,被显著上调。由于ABA和JA都被认为是种子萌发的抑制剂,因此ABA对种子萌发的最终抑制作用可能部分基于ABA促进的JA积累。


图6:脱落酸通过部分诱导茉莉酸积累抑制日本扁豆种子萌发


结果

外源ABA赋予SAPK10的第177个丝氨酸的自磷酸化,使其能够在很大程度上磷酸化第71个丝氨酸的bZIP72。SAPK10依赖的磷酸化增强了bZIP72蛋白对26S蛋白酶体介导的降解的稳定性,以及与AOC启动子G-box顺式元件的DNA结合能力,从而提高了AOC的转录,最终提高了内源JA浓度,从而协同抑制了种子萌发。


参考文献:

1:ABA is an essential signal for plant resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis. Plant Cell 19: 1665–1681. 

2:Cloning of novel rice allene oxide cyclase (OsAOC): mRNA expression and comparative analysis with allene oxide synthase (OsAOS) gene provides insight into the transcriptional regulation of octadecanoid pathway biosynthetic genes in rice. Plant Science 164: 979–992. 

3.The jasmonic acid-signalling and abscisic acid-signalling pathways cross talk during one, but not repeated, dehydration stress: a nonspecific ’panicky’ or a meaningful response? Plant, Cell & Environment 40: 1704–1710. 


下载原文

原文链接:https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.16774

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New Phytologist|SAPK10-bZIP72-AOC通路介导脱落酸和茉莉酸协同抑制水稻种子萌发
水稻种子的萌发与稻米品质和穗发芽抗性直接相关。我国南方高温多雨容易造成穗提早发芽的现象, 最终导致产量和品质的下降。深入解析种子萌发的遗传特性和分子机制,对于提高水稻的穗发芽抗性具有重要的意义。种子的萌发受到外界生长环境和内源激素的精细调节,其中激素对种子萌发的调控机制一直是种子生物学研究的热点问题。前人的研究主要集中在以ABA-GA (赤霉素) 拮抗为中心的调控通路。近年来大量的研究表明JA也是
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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