Plant Physiology|山东大学、山东省农科院研究人员揭示线粒体丙酮酸载体调控植物耐镉的机理

山东大学的研究人员于Plant Physiology上发表了一篇题为“Mitochondrial Pyruvate Carriers Prevent Cadmium Toxicity by Sustaining the TCA Cycle and Glutathione Synthesis”的研究文献,该文献揭示了线粒体丙酮酸载体通过维持TCA循环和谷胱甘肽合成来预防镉的毒性。

文章来源


背景

镉(Cd)是主要的重金属污染物,对植物造成严重的非生物胁迫。植物通过多种途径保护自己免受Cd胁迫。在最近的研究中,我们发现线粒体丙酮酸载体(MPC)参与拟南芥对Cd的耐受性。谷胱甘肽(GSH)是真核细胞中的主要氧化还原缓冲液,可以缀合Cd2+并减轻Cd毒性,线粒体丙酮酸载体(MPC)是糖酵解和三羧酸循环之间的关键因素。在此研究了MPC在植物Cd反应中的功能。研究结果表明,由MPC1和NRGA1(MPC2或MPC3)组成的MPC配合物可通过维持三羧酸循环和ATP的产生并减轻Glu在拟南芥中产生GSH的消耗来防止Cd胁迫。


结果

拟南芥对Cd的抗性需要AtMPC1

镉(Cd)是主要的重金属污染物,对植物造成严重的非生物胁迫。植物通过多种途径保护自己免受Cd胁迫。在最近的研究中,我们发现线粒体丙酮酸载体(MPC)参与拟南芥对Cd的耐受性。谷胱甘肽(GSH)是真核细胞中的主要氧化还原缓冲液,可以缀合Cd2+并减轻Cd毒性,线粒体丙酮酸载体(MPC)是糖酵解和三羧酸循环之间的关键因素。在此研究了MPC在植物Cd反应中的功能。研究结果表明,由MPC1和NRGA1(MPC2或MPC3)组成的MPC配合物可通过维持三羧酸循环和ATP的产生并减轻Glu在拟南芥中产生GSH的消耗来防止Cd胁迫。

为了鉴定AtMPC是否参与Cd抗性,利用 CRISPR/Cas9技术构建了两个突变体 mpc2-1和 mpc2-2,通过RT-PCR,RT定量PCR和测序确认突变株并用于Cd处理生物测定。结果表明,Cd处理下mpc1-1和mpc1-2的根长明显短于野生型植物和其他突变体的根长。为了进一步确认这种Cd敏感表型是否是由AtMPC1的缺失引起的,我们构建了pAtMPC1 :: AtMPC1以生成mpc1-1AtMPC1)互补转基因株系。结果表明AtMPC1是拟南芥对Cd耐受性所必需的。

图1:镉耐受性测试

图1. 镉耐受性测试


AtMPC1的功能丧失促进拟南芥中Cd2+的流入和积累

进一步研究mpc1-1中Cd耐受性的丧失,发现与野生型和互补系相比,在mpc1-1中发现了更高的Cd2+积累。作物种子和蔬菜芽中的Cd含量非常重要,与野生型和互补系相比,mpc1-1芽和种子中的镉含量也显著增加。这些结果表明,mpc1-1的Cd敏感性表型可能是由Cd积累引起的。

图2:镉含量测量和Cd通量测定

图2. 镉含量测量和Cd2+通量测定

为了研究镉的积累是否是由于植物根系对Cd2+的直接吸收所致,在根表皮区处测定了Cd2+通量。结果表明,AtMPC1可以防止植物Cd2+的积累,Cd2+的积累可能是由于Cd2+吸收增强或 Cd2+排出减弱。

 

拟南芥对Cd的抗性需要AtMPC复合物

研究发现MPC1可以在哺乳动物或酵母中与MPC2或MPC3形成蛋白质复合物,为研究MPC如何在植物中相互作用并发挥功能。用双分子荧光互补(BiFC)来测顶AtMPC1与AtMPC2或AtMPC3之间的相互作用。在阳性对照和两个测试的蛋白质组中检测到荧光信号,而与空载体相互作用的候选物未显示任何信号传导。由于BiFC系统无法避免自激活荧光,进行了免疫共沉淀(Co-IP)分析。结果表明AtMPC1可以与另一个AtMPC相互作用(AtNRGA1,AtMPC2或AtMPC3)以在拟南芥中形成三个AtMPC复合物。

根据AtMPC的相互作用模式,有可能需要功能性MPC复合物才能实现拟南芥对Cd的耐受性。进一步研究表明,在拟南芥中AtMPC复合体由AtMPC1和其他AtMPC组成,并以三种形式存在。这三种AtMPC复合物在拟南芥对Cd的耐受性中均起主要作用。此外,AtMPC1和其他AtMPC都是AtMPC复合物的必需亚基,是拟南芥对Cd耐受性所必需的。

图3:复合物是拟南芥对Cd耐受的必需物质

图3. MPC复合物是拟南芥对Cd耐受的必需物质

 

ScMPC突变体在酵母中显示出相似的Cd敏感性

酵母是用于细胞生物学基础研究的常见真核生物模型。在这项研究中,采用酵母来了解MPC的功能。在没有Cd的情况下,mpc1Δ 的酵母细胞的生长与野生型菌株JRY472 的生长相似。但在Cd处理情况下,mpc1Δ的细胞数显著少于野生型菌株的细胞数。为了证实MPC1在酵母中对Cd的耐受性中的功能,构建了酵母表达重组载体pScMPC1 :: ScMPC1以测试Cd耐受性。结果表明,ScMPC1和其他ScMPC(ScMPC2和ScMPC3)都是酵母对Cd耐受的必需元素,MPC突变体在拟南芥和酵母中显示出相似的Cd耐受性,因此MPC调控的Cd耐受机制可能相似。

图4.酵母中的Cd耐受性测试

图4. 酵母中的Cd耐受性测试

 

AtMPC1的功能丧失会破坏镉胁迫下的三羧酸活性

由于AtMPC1是这三种AtMPC复合体的基本组成部分,并且AtMPC1的功能丧失显示了与突变体相当的Cd敏感性,使用mpc1-1进一步研究AtMPC复合物响应Cd胁迫的分子机理。在酵母和某些动物中,MPC缺失会影响丙酮酸从细胞质到线粒体基质的转运。在植物中,没有证据表明MPC参与了这些过程。为了证实这一点,用未经Cd处理的野生型幼苗和mpc1-1以进行乙酰辅酶A测定。结果表明,在镉存在下,mpc1-1乙酰辅酶A含量显著降低。代谢分析表明,有Cd胁迫mpc1-1中丙酮酸的浓度升高,而在具有Cd胁迫的mpc1-1中三羧酸循环中间体的水平显著降低。

图5. 分析拟南芥线粒体中与三羧酸有关的代谢物

为了进一步确定细胞器水平的差异,在分离的拟南芥线粒体中进行了乙酰辅酶A和丙酮酸含量的测量。在Cd胁迫的mpc1-1中,乙酰辅酶A和丙酮酸的浓度均显著降低。这些结果表明AtMPC1突变体不能在镉胁迫下有效地产生乙酰辅酶A。

 

MPC平衡Glc和Glu消耗以维持拟南芥中的三羧酸活性

GSH是Cd2+螯合剂,可减轻真核细胞中的Cd胁迫,GSH还可作为主要的氧化还原缓冲液,用于缓解植物中Cd引起的氧化胁迫耐受性。在不存在Cd的情况下,mpc1-1中的GSH含量显著降低,表明GSH的合成被AtMPC复合物的功能丧失所中断。在Cd存在下,mpc1-1中的GSH水平远高于野生型植物。镉的积累可能刺激了谷胱甘肽的升高。

图6.向MPC1突变体提供Glu 可恢复Cd耐受性的野生型(WT)水平

图6. 向MPC1突变体提供Glu 可恢复Cd耐受性的野生型(WT)水平

与野生型植物相比,mpc1-1中的 Glu降低,并且在存在Cd的情况下,mpc1-1中的 Glu降低更为显著。结果表明,增加了Glu的消耗可以弥补由于拟南芥中AtMPC受损引起的Glc的损失。进一步研究表明,AtMPC复合物是维持乙酰辅酶A产生并驱动三羧酸循环的关键元素,因此释放Glu补充途径以生成GSH来缓解拟南芥中的Cd胁迫。

 

通过ATP排除Cd2+需要AtMPC

Cd2+转运蛋白在植物Cd2+积累或排除中起主要作用。Cd 2+转运蛋白都消耗ATP以从胞质溶胶中去除Cd 2+,从而保护基本代谢免受Cd 2+干扰。ATP主要通过三羧酸循环产生,乙酰辅酶A是主要来源。测量了mpc1-1和野生型植物的ATP含量。在镉处理下,mpc1-1中的ATP水平也降低。为验证ATP是否影响Cd 2+在根的表皮细胞中吸收或排除根,在野生型植物和没有ATP的mpc1-1的同一位置测量了Cd 2+通量。结果表明mpc1-1根中Cd 2+的流入量增加,这是由于根的表皮细胞中的Cd 2+转运蛋白的活性被干扰了。镉处理导致导致ATP水平降低且AtMPC复合物功能丧失。

图7.ATP改变拟南芥根中Cd

图7.ATP改变拟南芥根中Cd 2+的通量


结论

研究结果表明AtMPC是植物对Cd的耐受性所必需的,对植物的生长和发育都至关重要,包括种子发芽和根伸长。在Cd存在下,由于乙酰辅酶A的缺失,几乎所有通过三羧酸循环产生的代谢产物都会缺失。总体而言,这种调节机制涉及植物的多个方面。


参考文献:

   【1Bricker DK, Taylor EB, Schell JC, Orsak T, Boutron A, Chen YC, Cox JE, Cardon CM, Van Vranken JG, Dephoure N, Redin C, Boudina S, Gygi SP, Brivet M, Thummel CS, Rutter J (2012) A mitochondrial pyruvate carrier required for pyruvate uptake in yeast, Drosophila, and humans. Science 337: 96-100

2Herzig S, Raemy E, Montessuit S, Veuthey JL, Zamboni N, Westermann B, Kunji ER, Martinou JC (2012) Identification and functional expression of the mitochondrial pyruvate carrier. Science 337: 93-96

3Li CL, Wang M, Ma XY, Zhang W (2014) NRGA1, a putative mitochondrial pyruvate carrier, mediates ABA regulation of guard cell ion channels and drought stress responses in Arabidopsis. Mol Plant 7: 1508-1521


文章链接:http://www.plantphysiol.org/content/early/2019/02/15/pp.18.01610

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