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Plant,Cell&Environment|南京农业大学揭示OsNRAMP1在镉锰吸收中的作用

大米是我国重要的实物来源之一,对于以大米为主食的人群来说,大米是有毒金属镉最重要的膳食来源。长期接触镉可导致人类严重的健康问题。最近的一项总膳食研究表明,中国普通人群中,大米占总镉摄入量的56%。一些亚洲国家的部分人群的镉摄入量超过了粮农组织/世卫组织建议的最低摄入量水平。与其他重金属相比,Cd从土壤到粮食作物可食部分具有很高的转移性。此外,水稻似乎比其他主要谷类作物具有更高的吸收镉的能力。土壤污染和酸化进一步增加了土壤中有效镉的含量,导致镉在水稻籽粒中的累积超过了最大允许限值。了解植物如何吸收和运输Cd,对于制定减少Cd在粮食作物,特别是水稻中积累的风险的策略至关重要。

近日,南京农业大学资源与环境科学学院作物遗传与种质改良国家重点实验室在Plant,Cell&Environment在线发表了题为“OsNRAMP1 contributes to cadmium and manganese uptake in rice”的研究论文发现水稻基因OsNRAMP1在酵母中表达时能够转运镉和锰,但不转运Fe或As。敲除OsNRAMP1后,水稻根系对镉、锰的吸收和积累显著降低,对缺锰的敏感性增强,总之,OsNRAMP1对水稻对锰、镉的吸收有显著贡献。

文章来源

为了测定OsNRAMP1在酵母中是否对Cd,Mn,Fe(II)和As(III)有转运活性,实验发现在10μM或20μM Cd存在下,与空载体对照相比,表达OsNRAMP1或OsNRAMP5的酵母的生长受到损害。通过在Mn缺陷的酵母突变株中异源表达OsNRAMP1和OsNRAMP5进行互补试验中发现在2 mM锰螯合剂EGTA诱导的酵母中OsNRAMP1或OsNRAMP5的表达拯救了突变体的生长。OsIRT1的表达恢复了在添加4或8µM Fe(II)-螯合剂BPDS诱导的Fe(II)限制条件下Δfet4fet3的生长缺陷,而OsNRAMP1的表达不能挽救突变体的生长缺陷。在表达OsNRAMP1或空载体的酵母细胞中,总As浓度没有显著差异,而表达OsLsi1的酵母细胞累积As(III)比空载体对照多7.1倍,结果表明,OsNRAMP1在酵母中表达时对Mn和Cd都有转运活性,但对Fe(II)和As(III)没有转运活性。

图1:酵母中OsNRAMP1转运活性的测定

图1:酵母中OsNRAMP1转运活性的测定


为了研究OsNRAMP1基因表达的组织和细胞特异性,研究人员构建了转基因水稻,结果显示,在没有Cd的情况下,OsNRAMP1主要在根的成熟区表达,在根尖和侧根很少表达。暴露于0.5μM镉5天不仅增加了根成熟区的GUS活性,而且增加了侧根和根尖的GUS活性。

图2:pOsNRAMP1中GUS活性的组织化学染色

图2:pOsNRAMP1中GUS活性的组织化学染色


为了进一步研究敲除OsNRAMP1对水稻籽粒镉、锰积累的影响,选择了3个OsNRAMP1突变株系(L1、L3和L4)、1个OsNRAMP5(L1)和WT(cv。ZH11)在Cd污染的水稻土中进行盆栽试验。成熟时,OsNRAMP1突变体株高、籽粒、秸秆生物量与野生型无显著差异,而OsNRAMP5的籽粒和秸秆生物量明显小于野生型,与野生型相比,OsNRAMP1突变体外壳中的Cd和Mn浓度分别降低了47.4-56.0%和19.1-32.6%,而OsNRAMP5突变体的外壳Mn浓度分别下降了92.4%和85.1%。敲除OsNRAMP1或OsNRAMP5对谷物和外壳中Fe和As的浓度没有显著影响。OsNRAMP1和OsNRAMP5突变体在谷粒中的锌和铜浓度略高于WT。

图3: osnramp1、osnramp5突变体和野生型在盆栽试验中生长

图3: osnramp1、osnramp5突变体和野生型在盆栽试验中生长


结论

在本研究中,我们发现OsNRAMP1参与了水稻根中Mn和Cd的吸收以及它们在茎和籽粒中的积累。OsNRAMP1在酵母中的异源表达表明OsNRAMP1能够同时转运Cd和Mn。除镉外,我们的研究结果表明,OsNRAMP1在Mn限制条件下可以挽救酵母的Mn摄取缺陷突变体,表明OsNRAMP1可以转运Mn。与WT相比,敲除OsNRAMP1使Cd流入水稻根系的Vmax降低了47%。在多个敲除系和不同水培试验中,敲除OsNRAMP1使Cd和Mn的总摄取量分别减少32%和27%,。此外,当植株生长在中度污染的水稻土中时,敲除OsNRAMP1使水稻籽粒中镉和锰的浓度降低了35%和16%。在长期锰限制条件下,OsNRAMP1基因敲除也加重了锰缺乏症状,进一步支持了其在锰获得中的作用。

参考文献:

【1】Åkesson,A.,Barregardhl,I.A.,Nordberg,G.F .,Nordberg,M.,Skerfving,S. (2014).Non-renal effects and the risk assessment of environmental cadmium exposure. Enviromental Health Perspective, 122, 431-438.

【2】Alejandro, S., Cailliatte, R., Alcon, C., Dirick, L., Domergue, F ., Correia, D., Castaings, L., Briat, J.F ., Mari, S., Curie, C. (2017). Intracellular Distribution of manganese by the trans-Golgi network transporter NRAMP2 is critical for photosynthesis and cellular redox homeostasis. The Plant Cell, 29, 3068-3084.

【3】Clemens, S., Ma, J.F . (2016). T oxic heavy metal and metalloid accumulation in crop plants and foods. Annual Review of Plant Biology, 67, 489-512.

原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.13843

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Plant,Cell&Environment|南京农业大学揭示OsNRAMP1在镉锰吸收中的作用
近日,南京农业大学资源与环境科学学院作物遗传与种质改良国家重点实验室在Plant,Cell&Environment在线发表了题为“OsNRAMP1 contributes to cadmium and manganese uptake in rice”的研究论文,发现水稻基因OsNRAMP1在酵母中表达时能够转运镉和锰,但不转运Fe或As。敲除OsNRAMP1后,水稻根系对镉、锰的吸收和积累显著降
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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