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Plant Physiology|中国水稻研究所吴建利团队利用酵母双杂首次揭示了维持水稻类囊体膜稳定的新分子机制

   在植物叶片中,成熟的叶绿体由原生质体发育而来,原生质体是一种无色、小的前体,具有被包围的内外包膜和基本的内膜。这些原始膜在叶片发育过程中形成无规类囊体膜系统。类囊体膜复合物由光系统、细胞色素b6f、光系统IATP合成酶4种主要蛋白复合物组成。类囊体膜的生物发生涉及多种过程,如基因转录调控、翻译后调控和修饰和蛋白质复合物组装。在叶绿体中,类囊体膜被定期堆叠以增加膜面积以获得更高的光合效率,而发育良好的类囊体膜系统也与叶绿体的发育密切相关。迄今为止,已经鉴定出在66低温下叶绿体发育中显示出关键调控作用的基因,而影响叶绿体发育与细胞内代谢物之间关系的遗传因素目前尚不清楚。

文章来源

近日,中国水稻研究所 吴建利研究员课题组在国际学术期刊 Plant Physiology(IF:6.902)在线发表了题为“The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice的研究论文。该研究首次揭示了ATP结合盒式转运蛋白(ATP-binding cassette transporter I family member 7, OsABCI7)通过与高叶绿荧光蛋白(HIGH CHLOROPHYLL FLUORESCENCE 222, OsHCF222)互作,从而维持水稻类囊体膜稳定的分子机制。

为了验证OsABCI7是否如预测的那样定位于叶绿体,研究人员将OsABCI7的完整CDS融合到由CaMV35S启动子驱动的GFP的N端,在水稻原生质体中瞬时表达。OsABCI7-GFP融合蛋白确实定位于叶绿体。值得注意的是,ΔOsABCI7-GFP融合蛋白也定位于叶绿体,表明OsABCI7的突变并没有改变其叶绿体的定位。

图1:OsABCI7的亚细胞定位

图1:OsABCI7的亚细胞定位

为了确定OsABCI7的功能途径,研究人员还进行了酵母双杂交(Y2H)试验来筛选与OsABCI7相互作用的蛋白质。观察到OsABCI7和OsHCF222之间的相互作用,但没有观察到ΔOsABCI7和OsHCF222之间的相互作用。因此,我们推测OsABCI7的H环基序是相互作用所必需的。研究人员还研究了OsABCI7与OsHCF222的相互作用。结果表明,两种OsABCI7(+H-环)和OsABCI7(–H-环)不能与OsHCF222相互作用。这表明OsABCI7的C端是OsABCI7与OsHCF222之间相互作用的关键。此外,这种相互作用通过体内共免疫沉淀(co-IP)和BiFC分析进一步证实,表明OsABCI7与水稻叶绿体和本氏烟草细胞中的OsHCF222相互作用。所有这些都证明了OSABCI7与OsHCF222在体内外的相互作用。

图2:OsABCI7与OsHCF222的相互作用

图2:OsABCI7与OsHCF222的相互作用

结论

OsABCI7/OsHCF222复合物位于叶绿体的类囊体膜上,通过介导抗氧化系统从而调控细胞内ROS的稳态,以维持类囊体膜的完整与稳定。而在cnl1中,由于目标基因OsABCI7突变位点的存在,导致OsABCI7/OsHCF222复合物不能正常形成,最终引起了活性氧的迸发,使类囊体膜遭到了破坏。同时,外源抗氧化剂ascorbic acid(AsA)能够在一定程度上减轻cnl1中ROS的压力,从而缓解cnl1的突变表型。与cnl1不同的是,OsHCF222敲除突变体虽然也呈现出叶片褪绿的表型,但因其不能进行光合自养,致使苗期死亡。因此,研究人员推断OsABCI7与OsHCF222可能是在独立的调控途径中起协同作用。 总而言之,该研究为水稻ABC蛋白功能的丰富提供了新的依据,特别是在ROS稳态与类囊体膜稳定分子机制方面。


参考文献:

1Ahmad P, Jaleel AC, Salem AM, Nabi G, Sharma S (2010) Roles of enzymatic and nonenzymatic antioxidants in plants during abiotic stress. Crit Rev Biotechnol 30: 161–175.

2Asada K, Kiso K, Yoshikawa K (1974) Univalent reduction of molecular oxygen by  spinach chloroplasts on illumination. J Biol Chem 249: 2175–2181.

3Asada K (1992) Ascorbate peroxidase – a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in  plants. Physiol plantarum 85: 235–241.

文献链接http://www.plantphysiol.org/content/early/2020/07/13/pp.20.00445

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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