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The Plant Journal|中国水稻研究所种质创新课题组揭示了水稻主要光合电子传递蛋白OsFdI对水稻生长发育的影响

背景

Fd广泛存在于各种植物、动物及微生物体内参与电子传递。在光合过程中,光系统接受光子,经过各个电子传递蛋白,最终将光能转化为化学能,光合型Fd作为唯一的可溶性电子受体,可将来自光系统I的电子传输到下游各种Fd依赖的代谢过程,涉及碳同化、氮同化、硫同化、叶绿素代谢、光敏色素合成、脂肪酸合成等诸多生物学途径,是光合电子向多种生物学途径分配的中枢元件,对水稻的生长发育至关重要。


文章来源


中国水稻研究所种质创新课题组在The Plant Journal在线发表了题为“Primary Leaf-type FerredoxinI Participates in Photosynthetic Electron Transport and Carbon Assimilation in Rice的研究论文。该研究首次明确并揭示了水稻主要光合电子传递蛋白OsFdI对水稻生长发育的影响,为阐明水稻不同铁氧还蛋白(Ferredoxin,Fd)在调控光合电子向下游代谢途径分配的分子机制奠定了基础。


结果

Fd1参与叶绿体的光合电子传递和功能

为了研究Fd1和FdC2是否参与了水稻光合电子传递,对Fd1和FdC2进行了细胞色素c和NADP+光还原实验。我们发现Fd1和FdC2支持细胞色素c的光还原。然而,FdC2不支持NADP+的光还原,表明FdC2不能向FNR贡献电子来生成NADPH。结果表明,Fd1是水稻主要的光合电子传递蛋白,参与水稻光合碳同化。


图1:Fd1和FdC2蛋白电子传递能力检测

1:Fd1和FdC2蛋白电子传递能力检测

 

为了研究Fd1的亚细胞定位,研究人员在水稻原生质体中表达了Fd1绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白。然后,我们转化空的GFP载体和一个p35S::Fd1的GFP载体,其中包含Fd1的全长cDNA,结果显示Fd1-GFP信号与叶绿体的叶绿素自荧光信号共定位,表明Fd1位于水稻叶绿体中。


图2:水稻原生质体中蛋白的亚细胞定位

2:水稻原生质体中Fd1-GFP蛋白的亚细胞定位


OsFd1功能的破坏导致黄化和幼苗死亡

为了研究OsFd1的功能,我们利用CRISPR/Cas9策略在NPB背景下产生了几个独立的OsFd1突变株系。种子萌发后,fd1突变体均无明显异常。然而,突变体在两叶期逐渐失绿,开始迅速脱水,然后在三叶期死亡。在fd1突变体中OsFd1的表达水平显著低于WT-OsFd1植株。这说明OsFd1对水稻的发育至关重要,OsFd1功能的破坏会导致水稻黄化和幼苗死亡。


图3:OsFd1功能的破坏导致黄化和幼苗死亡

3:OsFd1功能的破坏导致黄化和幼苗死亡

 

结论

该研究明确了FdI是水稻中主要的光合碳同化电子传递蛋白,加深了对Fd参与水稻光合电子传递的分子机制以及Fd对水稻生长发育的影响的理解。为进一步阐明水稻不同Fd在调控光合电子向下游代谢途径分配的分子机制奠定了基础。

 

参考文献:

【1】Andersen, B.,Scheller,H.V.and Møller,B.L.(1992) The PSI‐E subunit of

photosystem I binds ferredoxin:NADP+ oxidoreductase.Febs Letters, 311,

169-173.

【2】Arnon,D.I.(1949)  Copper  enzymes  in  isolated  chloroplasts.

Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology, 24, 1-15.

【3】Coruzzi, G.M. (2003) Primary N-assimilation into Amino Acids inArabidopsis:

SPIE.

文章来源https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.14904

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The Plant Journal|中国水稻研究所种质创新课题组揭示了水稻主要光合电子传递蛋白OsFdI对水稻生长发育的影响
中国水稻研究所种质创新课题组在The Plant Journal在线发表了题为“Primary Leaf-type FerredoxinI Participates in Photosynthetic Electron Transport and Carbon Assimilation in Rice”的研究论文。该研究首次明确并揭示了水稻主要光合电子传递蛋白OsFdI对水稻生长发育的影响,为阐明
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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