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Science|山东农业大学小麦抗赤霉病真菌Fhb7基因水平转移研究

镰刀菌枯萎病已成为世界各地小麦和大麦种植者日益关注的问题。它也称为小麦赤霉病,在这种疾病中,致病真菌镰刀菌会吞噬此类植物中的籽实,从而降低产量。更糟糕的是,它会在未食用的籽实中留下毒素,使其无法销售。被称为小麦“癌症”的赤霉病是农业领域的世界性难题,严重威胁粮食生产和食品安全,是各国政府格外关注并亟待解决的重大问题。

山东农业大学孔令让团队在《Science(IF:41.845)杂志以 “First Release”的形式发表题为“Horizontal gene transfer of Fhb7 from fungus underlies Fusarium head blight resistance in wheat”的研究长文,该研究成功克隆了来源于长穗偃麦草的抗赤霉病主效基因Fhb7。 这是我国小麦研究领域首篇Science文章,也是小麦重要功能基因研究领域的首篇CNS三大主刊文章。


 

专家点评 

邓兴旺,美国国家科学院院士,原耶鲁大学终身讲座教授,北京大学现代农业研究院首席科学家

“这是一篇非比寻常的宏大论文,其报道的五大研究内容系统、精辟,其中任何一个进展皆足以在任何权威期刊上发表。阅读这篇论文会给读者带来一次非凡的科学之旅,确实是一篇难得一见的好文章。本论文首次报道了克隆的小麦抗赤霉病基因Fhb7具有广谱的解毒功能。小麦赤霉病由镰刀菌属真菌,主要是禾谷镰刀菌侵染而导致。镰刀菌属广泛分布于自然界中,可以侵染多种农作物和经济作物,引起小麦、大麦、和燕麦的赤霉病和茎基腐病以及玉米的穗腐病等。镰刀菌侵染作物后分泌的单端孢霉烯族毒素是目前小麦、玉米等粮食及其加工产品中主要的毒素来源。这种真菌疾病一直威胁着全球小麦的产量和质量(受感染的谷物含有毒性很强的呕吐毒素),也是制约我国及世界粮食安全和食品安全的重要因素。

 

本人有幸一览此研究的全文,五大研究内容承前启后无缝地交织成一个完整的科学故事,阐释了一个极具关键战略意义、又饱受关注的重要基因:抗赤霉病基因Fhb7,该基因可赋予小麦对赤霉病的抗性。

 

这五大研究内容具体包括:

(1)一个复杂的长穗偃麦草基因组的高质量的组装和注释,长穗偃麦草携带抗病、抗逆、优质等许多优异基因,在小麦远缘杂交育种中广泛应用,抗赤霉病基因Fhb7 就来源于长穗偃麦草基因组;

 

(2)一个由抗病新基因支持的简练的基因克隆故事,本研究采用传统图位克隆技术,巧妙地使用细胞遗传学、突变基因组学、病毒诱导的基因沉默(VIGS)和转基因技术进行功能验证,以证明所确定基因的必要性和充分性;

 

(3)Fhb7基因编码一种谷胱甘肽S-转移酶(GST),对包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)(又称呕吐毒素,被世界卫生组织列为三类致癌物质)在内的很多主要的单端孢霉烯族毒素,如NIV、T2、HT-2等都具有广谱的解毒功能。随后,该研究团队通过一系列分子实验和高分辨质谱分析,进一步揭示了Fhb7编码的蛋白可以打开DON毒素的环氧基团,并催化其形成谷胱甘肽加合物(DON-GSH),从而产生解毒效应。该研究揭示的谷胱甘肽S-转移酶(GST)技术有望产业化并应用于粮食深加工和饲料工业,去除食品中的相关毒素,具有重要的市场前景;

 

(4)田间试验证明携带Fhb7基因的长穗偃麦草染色体片段在不同背景小麦中对产量性状没有产生明显的负面影响,是禾谷类作物种质改良和创新难得的好基因;(5)本研究还有一个惊人的发现,Fhb7看来是通过水平基因转移(HGT)从真菌转入植物!这是一个极其少见的生物基因跨界转移现象,值得进一步深入研究,以探讨植物抗病基因和基因组进化新机制。

 

我期待并完全相信,这篇文章报道的故事将引起科学家及大众广泛的关注,包括那些致力于植物-病原体相互作用、谷物基因组学、植物基因组进化、植物遗传修饰、植物育种(特别是抗病性)的研究人员,甚至世界各国决策者的广泛关注。”

 

康振生,中国工程院院士,西北农林科技大学教授

“由于小麦基因组庞大以及小麦-真菌互作的复杂性,目前,科研工作者对小麦抗赤霉病机制的了解还十分有限。近年来,孔令让教授科研团队在长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7开展的一系列研究工作,不但为培育抗赤霉病小麦品种提供了宝贵的基因资源,同时还明确了Fhb7编码的蛋白可以打开单端孢霉烯族毒素的环氧基团,并催化其形成谷胱甘肽加合物(DON-GSH),从而产生解毒效应。另外,本研究还首次提供了真核生物间核基因组 DNA 水平转移的功能性证据,为进一步探索植物抗病基因和基因组进化机制提供了一条新途径。”

 

文章解读

一、研究背景

鉴于小麦种质资源中被发现的主效抗赤霉病基因非常稀少,孔令让教授团队自2000年开始,尝试从小麦近缘植物长穗偃麦草中发掘赤霉病抗源,并经过持续20年的研究发现、遗传定位和命名了主效抗源Fhb7, 为了克隆与精准利用该基因,本研究工作包括以下内容:

 

二、研究结果

1、首次完成了二倍体长穗偃麦草基因组(E)的组装、注释和比较基因组学分析;根据参考基因组开发分子标记,利用小麦-长穗偃麦草异代换系(7D/7E)构建的作图群体,完成Fhb7的精细定位;通过筛选BAC文库,构建了抗病亲本物理图谱,将该基因锁定在245 Kb的物理区间内,并获得唯一表达的候选基因(功能注释为谷胱甘肽转移酶, Gluthanione S-transferase);通过BMSV诱导基因沉默、TILLING突变体、小麦转基因研究等验证了该基因的功能,确认其为Fhb7 (图1)。

 

图1:长穗偃麦草基因组分子进化与Fhb7的图位克隆

 

2、首先从DON毒素入手,发现Fhb7编码的蛋白可以打开DON毒素的环氧基团,并催化其形成谷胱甘肽加合物(DON-GSH),从而产生解毒效应。(注:自1970年代,已知环氧基为DON毒素的核心毒性结构,本研究首次发现Fhb7编码的蛋白可以催化其去环氧化从而实现解毒功能)。

 

鉴于该环氧基团在A型和B型单端孢霉烯族毒素中的保守性,进一步研究发现Fhb7具有广谱解毒功能,即可以对3-ADON、15-ADON、NIV、T2、HT-2、Fus-X、Das等一系列镰刀菌属分泌的毒素进行GSH衍生化。这种广泛的解毒能力也使Fhb7对镰刀菌属病原菌具有广谱抗性,其转基因植株对小麦赤霉病和茎基腐病均表现明显抗性(图2C-图2F)。

 

3、整个植物界未发现Fhb7的同源基因,而禾本科植物内生真菌Epichloë 基因组中存在基因与Fhb7相似性高达97%。该结果暗示,二倍体长穗偃麦草早期可能与Epichloë形成共生体,通过基因水平转移将Epichloë Fhb7的DNA整合到长穗偃麦草基因组中,从而进化出抗镰刀菌属病原菌侵染的功能(图2A-图2B)(注:该发现首次提供了真核生物间核基因组DNA水平转移的功能性证据)。

 

图2:Fhb7的遗传进化机理与抗病功能分子机理

 

4、本研究利用远缘杂交结合分子标记辅助选择将携带Fhb7的染色体片段转移至栽培小麦品种,通过多年的表型鉴定发现,在多种不同的遗传背景下,Fhb7均显著提高小麦赤霉病和茎基腐病抗性,而对产量无显著的影响(图3)。

 

图3:抗赤霉病基因Fhb7的转移利用

 

三、主要研究结论本研究最终证明Fhb7最早可能来源于禾本科内生真菌Epichloë 属,并在内生真菌与长穗偃麦草建立共生体中发挥作用,帮助后者抵御镰刀菌属病原菌。而后,Fhb7被吸收并整合到二倍体长穗偃麦草基因组从而使其进化出镰刀菌抗性。进一步通过远缘杂交将含有该基因的长穗偃麦草染色质片段转移到普通小麦背景,从而实现了小麦赤霉病和茎基腐病抗性。Fhb7针对镰刀菌属的广谱抗性主要是因为其可以作为一种酶广泛催化单端孢霉烯族毒素去环氧基化,导致该家族毒素作为致病因子失去毒性(图4)。

图4:Fhb7的跨物种转移和抗赤霉病分子机理

 

研究团队合影(左起郝永超、薄存瑶、王宏伟、李安飞、孙思龙、孔令让、马信)

 

作者贡献

本研究的通讯单位为山东农业大学,通讯作者为孔令让教授;王宏伟为第一作者和通讯作者;山东农业大学孙思龙副教授、博士研究生葛文扬、博士后赵兰飞、博士研究生侯冰倩、博士研究生吕忠璠和诺禾致源生信工程师王凯为共同第一作者。本文主要参与人还包括中国科学院遗传发育研究所高彩霞研究员,美国农业部中西部应用研究中心柏贵华教授,美国农业部红河流域农业研究中心许树军教授,美国普渡大学Herbert Ohm教授,以色列海法大学Eviatar Nevo教授,山东农业大学李安飞研究员、倪飞副教授,山东省农科院郭军助理研究员以及烟台大学李家柱副教授等。本研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划、转基因重大专项、山东省农业良种工程及山东省现代农业产业技术体系的资助。(注:本研究受独立知识产权保护,部分研究成果已申报专利)。

 

文章转载自植物科学最前沿,如有侵权请联系删除。


原文链接:https://science.sciencemag.org/content/early/2020/04/08/science.aba5435

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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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