中国亚林所通过酵母高通量筛选技术揭示了镉抗逆相关功能基因

随着工业的发展,重金属污染对生物造成严重威胁,根据其生物有效性浓度和受体暴露敏感性,重金属具有潜在毒性,在这些金属中,那些类似于离子价态营养素的元素(如Hg、Pb和Cd)被认为构成了更大的威胁,因为它们可以通过现有的矿物吸收通道被植物吸收和利用,如何有效地减轻重金属污染的问题已经引起了全世界的关注。


植物修复是利用自然发生或基因工程植物去除污染土壤和水体中的污染物的一种方法,为了加强植物修复,探索了与镉超耐受或超积累有关的功能基因。因此,有必要阐明超积累植物中金属积累和耐受的机制,并挖掘与吸收有关的基因。

 

中国林科院亚热带林业研究所的研究人员在期刊Environ.Sci.Technol发表了名为“cDNA library for mining functional genes in Sedum alfredii Hance relatedto cadmium tolerance and characterization of the roles of a novel SaCTP2 genein enhancing cadmium hyperaccumulation”的文章,该文揭示了利用酵母高通量筛选技术挖掘出的与Cd超耐性相关的候选基因,是培育用于植物修复的基因工程植物的有效途径。


研究方法

1.非生物胁迫处理

2.构建cDNA文库

3.酵母功能互补验证及表达图谱

4.转基因植物表型和生理生化检测分析


研究结果

研发人员发明了一种通过表达S.alfredii Hance cDNA文库来筛选与Cd耐性相关的基因的方法。酵母功能互补验证了48个与Cd耐性相关的全长基因中的42个,其中大部分在根中被强烈诱导,并在不同组织中表现出不同的表达谱。共表达网络分析表明,15个HUB基因与代谢过程、刺激反应、金属转运蛋白和抗氧化活性相关。通过在拟南芥中的异源表达验证了SaCTP2基因的功能,该基因具有延缓叶绿素含量下降、维持细胞膜完整性、促进活性氧清除剂(ROS)清除活性和降低ROS水平的功能。研究结果表明,东南景天存在一个高度复杂的与镉高度耐受相关的基因网络,该网络是通过抗氧化系统、防御基因诱导和钙信号通路完成的。所提出的cDNA文库方法是挖掘与Cd超耐性相关的候选基因以培育用于植物修复的基因工程植物的有效途径。

图:利用酵母互补法对Cd敏感菌株Δycf1中48个与Cd耐受性相关的候选基因进行验证


按照传统的酵母杂交流程一般是先选择诱饵基因,从文库中钓取互作蛋白,然后提取质粒、测序、一对一验证等。这样子做针对性较强,没毛病,但不可否认的是工作量确实大。当你想要筛选动植物在逆境环境条件下表达的抗逆基因,这时候的工作量就更大了。而在文章中,研究人员应用了一个新技术—酵母高通量筛选


何为酵母高通量筛选?

酵母菌为真核生物,与植物、动物表达系统更为接近,也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程,从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥,多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。利用酵母菌,在逆境系统下,检测酵母菌表达可溶性蛋白是否可以帮助酵母菌度过逆境胁迫。通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查,并对筛查的结果进行了生物信息学分析,将这些抗逆基因进行归纳、分类。


实验流程

酵母高通量筛选抗逆基因

抗逆基因功能性验证


技术特点

高通量筛选:酵母高通量抗逆基因筛选服务能够快速筛选岀非模式抗逆物种资源中的多重逆境抗性相关的大量基因,将具有非常重要的意义。

可溶性真核表达:利用蛋白组学寻找候选蛋白,进行蛋白水平上的表型验证。
敏感性酵母菌株YCF1/BY4741/ InVSCI,是单细胞真核微生物,具有生长迅速,易于遗传操作,可分泌表达外源蛋白等特点,能对外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,是表达外源蛋白的合适宿主。
pYES2 载体是为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计的,该载体含有诱导性启动子 GAL,在半乳糖存在情况下,大量诱导外源蛋白表达,而在葡萄糖存在的情况下,抑制外源蛋白表达,且含有ura3 基因,利于对ura3 缺失体宿主菌阳性克隆的筛选。


应用领域

耐药性:药用生物耐药机制研究等

   重金属:生物重金属修复机制研究等
   抗逆性:生物抗逆性功能蛋白研究等

中国亚林所通过酵母高通量筛选技术揭示了镉抗逆相关功能基因
随着工业的发展,重金属污染对生物造成严重威胁,根据其生物有效性浓度和受体暴露敏感性,重金属具有潜在毒性,在这些金属中,那些类似于离子价态营养素的元素(如Hg、Pb和Cd)被认为构成了更大的威胁,因为它们可以通过现有的矿物吸收通道被植物吸收和利用,如何有效地减轻重金属污染的问题已经引起了全世界的关注。
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