密苏里大学研究人员利用酵母表达烟曲霉PDR5类ABC转运蛋白的外排能力和底物特异性

丝状真菌病原体烟曲霉是人类侵袭性霉菌感染的最常见原因,与惊人的高死亡率相关。目前可用于治疗侵袭性曲霉菌病的抗真菌药物非常有限,要么是由于安全性和对宿主的毒性问题,要么是因为它们的作用模式狭窄,导致产生耐药性。此外,丝状真菌通常对常用于治疗其他类型真菌感染的抗真菌药物具有内在抗性,例如烟曲霉对氟康唑(FLC)的耐药性。


密苏里大学大学研究人员在期刊mBIO(IF:6.784)上发表了名为“Characterization of the Efflux Capability and Substrate Specificity ofAspergillus fumigatus PDR5-like ABC Transporters Expressed in Saccharomycescerevisiae”的文章,文章中介绍了研究人员将烟曲霉基因abcA、abcC、abcF、abcG、abcH和abcI克隆到质粒中,并在一株高活性内源性ABC转运蛋白基因PDR5缺失的酿酒酵母菌株中进行过度表达筛选,结果表明在底物特异性和能量依赖性外排方面存在有趣的差异。表达这些基因的菌株对被认为是外排泵底物的各种药物表现出不同程度的耐药性。

研究策略

外排试验

烟曲霉菌RNA提取,转运子选择和cDNA合成

质粒构建

酿酒酵母背景菌株的构建及MIC药敏试验

烟曲霉菌 临床分离菌株基因表达的RT-QPCR检测


研究结果

表达abcC和abcF的菌株对许多被测唑类药物的MIC80均增加,包括克霉唑(CLT)、FLC、伊曲康唑(ITC)、酮康唑(KTC)、泊沙康唑(POS)和戊唑醇(TEBZ),这表明唑类药物具有很强的底物特异性。这两种运输工具之间有一些区别。表达abcC的菌株对伏立康唑(VRC)有明显的抗性,而表达abcF的菌株对伏立康唑MIC仅略有增加。abcF菌株对益康唑(ECON)、叶菌唑(MET)、咪康唑(MCZ)和咪鲜胺(PCLZ)表现出明显的抗性,而abcC没有。此外,abcF对两性霉素B(AMB)、刚果红(CR)和钙氟白(CW)具有明显的敏感性。表达abcF和abcA的菌株,abcC、abcH和abcI也显示mic80增加到罗丹明6G(R-6G),这是许多ABC转运蛋白的已知底物。

图:药敏琼脂斑点试验


研究结论

研究表明,ABC转运蛋白是临床上重要的一类转运蛋白,在大多数真菌物种中还未被研究和神秘。研究结果突出了ABC转运蛋白在同一生物体内的显著多样性、底物特异性和进化差异,并证明了外排泵作为烟曲霉多药耐药因素之一的相关性。


酵母高通量技术介绍

酵母菌为真核生物,与植物、动物表达系统更为接近,也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程,从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥,多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。利用酵母菌,在逆境系统下,检测酵母菌表达可溶性蛋白是否可以帮助酵母菌度过逆境胁迫。通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查,并对筛查的结果进行了生物信息学分析,将这些抗逆基因进行归纳、分类。


实验流程

酵母高通量筛选抗逆基因

抗逆基因功能型验证


技术特点

高通量筛选:酵母高通量抗逆基因筛选服务能够快速筛选岀非模式抗逆物种资源中的多重逆境抗性相关的大量基因,将具有非常重要的意义。

可溶性真核表达:利用蛋白组学寻找候选蛋白,进行蛋白水平上的表型验证。
敏感性酵母菌株:YCF1/BY4741/InVSCI,是单细胞真核微生物,具有生长迅速,易于遗传操作,可分泌表达外源蛋白等特点,能对外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,是表达外源蛋白的合适宿主。
pYES2载体是为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计的,该载体含有诱导性启动子 GAL,在半乳糖存在情况下,大量诱导外源蛋白表达,而在葡萄糖存在的情况下,抑制外源蛋白表达,且含有ura3 基因,利于对ura3 缺失体宿主菌阳性克隆的筛选。

应用领域
   耐药性药用生物耐药机制研究等
   重金属:生物重金属修复机制研究等

    抗逆性:生物抗逆性功能蛋白研究等

 

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密苏里大学研究人员利用酵母表达烟曲霉PDR5类ABC转运蛋白的外排能力和底物特异性
丝状真菌病原体烟曲霉是人类侵袭性霉菌感染的最常见原因,与惊人的高死亡率相关。目前可用于治疗侵袭性曲霉菌病的抗真菌药物非常有限,要么是由于安全性和对宿主的毒性问题,要么是因为它们的作用模式狭窄,导致产生耐药性。此外,丝状真菌通常对常用于治疗其他类型真菌感染的抗真菌药物具有内在抗性,例如烟曲霉对氟康唑(FLC)的耐药性。
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