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南方科技大学翟继先利用CRISPR技术揭示DCL2依赖的22-nt小RNA调控大豆种皮颜色的机制
作者：南京瑞源生物技术有限公司
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发表时间：2020-10-20 13:47:00
在植物中，22-核苷酸(nt)小核糖核酸(sRNAs)触发次级小干扰核糖核酸(siRNAs)的产生，并增强沉默的独特能力。DICER-LIKE 2 (DCL2)依赖的22-ntSiRNA在拟南芥中很少见，被认为主要在病毒感染期间发挥作用；相比之下，这些siRNAs在许多作物中都很丰富，如大豆和玉米。然而，它们的功能仍然不清楚
2020年10月19日，南方科技大学生物系翟继先团队与中国农业科学院作物科学研究所刘斌团队合作在The Plant Cell在线发表了题为Soybean DCL2 regulates seed coat color via the production of primary 22-nt siRNAs from long inverted repeats的研究论文。研究结果表明，大豆中的内源性LIR转录物主要被转基因大豆蛋白2加工成22-nt siRNAs，并揭示了转基因大豆蛋白2在调节自然性状中的作用。
大豆DCL2a/2b的CRISPR-Cas9编辑
为了深入了解22-nt内源siRNAs在大豆中的作用，研究人员将CRISPR-Cas9技术应用于大豆品种天龙1号，获得了GmDCL2基因的功能缺失突变体。大豆基因组编码两个拷贝的DCL2，gmd c2a 99和gmd c2b；这些在编码的蛋白质序列中具有高度相似性(80.4%)。我们通过组织培养进行了CRISPR-Cas9介导的编辑。从多个独立突变系中，我们选择了三个纯合双突变系， Gmdcl2a/2b-8、Gmdcl2a/2b-9和Gmdcl2a/2b-16，用于进一步研究。所有三个都含有目标位点周围的缺失，导致GmDCL2a/2b编码区的移码和过早终止密码子。突变株系除了轻微矮化外，在植株结构中没有表现出明显的异常。最显著的表型变化是三个品系的种皮都是棕色的，与野生型天龙1号的黄色种皮形成对比。
GmDCL2a/2b中CRISPR/Cas9工程突变导致棕色种皮
依赖DCL2的22-nt siRNAs调节大豆种皮颜色
CHS是类黄酮生物合成的关键酶，类黄酮在大豆种皮中引起黑色/棕色色素。野生大豆材料有黑色或棕色的种皮，而商品大豆品种是黄色的，因为存在一个显性等位基因215的座位。ii等位基因包含两个相似的反向重复簇，每个簇包含三个CHS基因(CHS1、CHS3和CHS4)。该基因座是siRNAs的来源，siRNAs以反式方式靶向并沉默基因组中的其他CHS基因，并产生黄色种皮。除了CHS1和CHS3，我们还从其他CHS基因中检测到大量的二级siRNAs，如CHS2、CHS7和CHS8。这些小干扰核糖核酸的长度主要为21个核苷酸，由有义和反义链产生，表明依赖于核糖核酸的核糖核酸聚合酶(RDR)可能参与了dsRNA前体的产生。。我们的结果表明，DCL2依赖的22-nt siRNAs是维持CHS基因家族沉默和调节大豆种皮颜色所必需的。此外，通过比较WT和Gmdcl2a/2ab突变体的基因序列数据，我们鉴定了381个差异积累在叶片、种皮(包括多个CHS家族成员)和1912中的基因表明GmDCL2依赖性22-nt SirNA可以调节除CHS 281家族之外的基因表达。
DCL2依赖的22-nt SirNA调节CHS基因表达水平的模型
实验研究结果得出大豆中的内源性LIR转录本主要由GmDCL2s加工成22 nt siRNA，揭示了DCL2在调节自然性状中具有重要作用，并为改良大豆外观品质提供了新思路。
原文链接：http://www.plantcell.org/content/early/2020/10/19/tpc.20.00562
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