400-863-8520

TEL    025-57671761

图片展示

Plant Cell|南方科技大学翟继先利用CRISPR技术揭示DCL2依赖的22-nt小RNA调控大豆种皮颜色的机制

在植物中,22-核苷酸(nt)小核糖核酸(sRNAs)触发次级小干扰核糖核酸(siRNAs)的产生,并增强沉默的独特能力。DICER-LIKE 2 (DCL2)依赖的22-ntSiRNA在拟南芥中很少见,被认为主要在病毒感染期间发挥作用;相比之下,这些siRNAs在许多作物中都很丰富,如大豆和玉米。然而,它们的功能仍然不清楚



2020年10月19日,南方科技大学生物系翟继先团队与中国农业科学院作物科学研究所刘斌团队合作在The Plant Cell在线发表了题为Soybean DCL2 regulates seed coat color via the production of primary 22-nt siRNAs from long inverted repeats的研究论文。研究结果表明,大豆中的内源性LIR转录物主要被转基因大豆蛋白2加工成22-nt siRNAs,并揭示了转基因大豆蛋白2在调节自然性状中的作用。

 

大豆DCL2a/2bCRISPR-Cas9编辑

为了深入了解22-nt内源siRNAs在大豆中的作用,研究人员将CRISPR-Cas9技术应用于大豆品种天龙1号,获得了GmDCL2基因的功能缺失突变体。大豆基因组编码两个拷贝的DCL2,gmd c2a 99和gmd c2b;这些在编码的蛋白质序列中具有高度相似性(80.4%)。我们通过组织培养进行了CRISPR-Cas9介导的编辑。从多个独立突变系中,我们选择了三个纯合双突变系, Gmdcl2a/2b-8、Gmdcl2a/2b-9和Gmdcl2a/2b-16,用于进一步研究。所有三个都含有目标位点周围的缺失,导致GmDCL2a/2b编码区的移码和过早终止密码子。突变株系除了轻微矮化外,在植株结构中没有表现出明显的异常。最显著的表型变化是三个品系的种皮都是棕色的,与野生型天龙1号的黄色种皮形成对比。

GmDCL2a/2bCRISPR/Cas9工程突变导致棕色种皮

 

依赖DCL222-nt siRNAs调节大豆种皮颜色

CHS是类黄酮生物合成的关键酶,类黄酮在大豆种皮中引起黑色/棕色色素。野生大豆材料有黑色或棕色的种皮,而商品大豆品种是黄色的,因为存在一个显性等位基因215的座位。ii等位基因包含两个相似的反向重复簇,每个簇包含三个CHS基因(CHS1、CHS3和CHS4)。该基因座是siRNAs的来源,siRNAs以反式方式靶向并沉默基因组中的其他CHS基因,并产生黄色种皮。除了CHS1和CHS3,我们还从其他CHS基因中检测到大量的二级siRNAs,如CHS2、CHS7和CHS8。这些小干扰核糖核酸的长度主要为21个核苷酸,由有义和反义链产生,表明依赖于核糖核酸的核糖核酸聚合酶(RDR)可能参与了dsRNA前体的产生。。我们的结果表明,DCL2依赖的22-nt siRNAs是维持CHS基因家族沉默和调节大豆种皮颜色所必需的。此外,通过比较WT和Gmdcl2a/2ab突变体的基因序列数据,我们鉴定了381个差异积累在叶片、种皮(包括多个CHS家族成员)和1912中的基因表明GmDCL2依赖性22-nt SirNA可以调节除CHS 281家族之外的基因表达。

DCL2依赖的22-nt SirNA调节CHS基因表达水平的模型

 

实验研究结果得出大豆中的内源性LIR转录本主要由GmDCL2s加工成22 nt siRNA,揭示了DCL2在调节自然性状中具有重要作用,并为改良大豆外观品质提供了新思路。

原文链接:http://www.plantcell.org/content/early/2020/10/19/tpc.20.00562

阅读原文

Plant Cell|南方科技大学翟继先利用CRISPR技术揭示DCL2依赖的22-nt小RNA调控大豆种皮颜色的机制
2020年10月19日,南方科技大学生物系翟继先团队与中国农业科学院作物科学研究所刘斌团队合作在The Plant Cell在线发表了题为Soybean DCL2 regulates seed coat color via the production of primary 22-nt siRNAs from long inverted repeats的研究论文。研究结果表明,大豆中的内源性LIR
长按图片保存/分享
图片展示

电话:400-863-8520;025-5767-1761

邮箱:order@bestofbest.top

地址:南京市栖霞区江苏生命科技园F7栋

图片展示

微信公众号

图片展示

微信小程序

版权所有 南京瑞源生物技术有限公司       苏ICP备20003978号      技术支持:飞色网络

Copyright © 瑞源生物

苏ICP备20003978号

实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

联系电话
400-8638520
联系电话
025-57671761
二维码
二维码