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PNAS|兰州大学研究团队揭示BAK1缺失触发植物免疫反应的分子机制

植物类受体蛋白激酶BAK1在调控植物生长发育的过程中具有重要作用,同时BAK1也作为共受体与多个位于细胞膜上的模式识别受体 (Pattern Recognition Receptors, PRRs) 形成受体复合体介导植物的PTI (PRR-triggered immunity) 响应。兰州大学黎家教授团队于2007年首次报道了BAK1及其同源基因BKK1的缺失突变可直接导致植物在正常培养条件或无菌培养条件下均产生明显的免疫自激活反应,并提出BAK1除了参与植物油菜素内酯信号转导还参与植物的免疫调控。但是已知的几个模式识别受体PRRs的缺失突变体并不会产生免疫自激活,因此BAK1缺失后触发植物免疫的分子机理,以及产生这种免疫自激活的生物学意义到底是什么,一直是植物学界的未解之谜。

为此,黎家教授团队针对BAK1缺失后触发植物免疫自激活的现象开展了一系列深入细致的分子机制研究。通过转录组测序技术,系统分析了Col-0和bak1-4 bkk1-1突变体中的NLR(Nucleotide-Binding Leucine-Rich Repeat domain Receptor) 基因,发现大量NLR基因在bak1-4 bkk1-1突变体中上调表达。经过初步筛选并利用RNAi技术在bak1-3 bkk1-1突变体背景中沉默候选NLR基因,发现了ADR1 RNAi植株的免疫自激活表型受到明显抑制。通过遗传杂交获得adr1 adr1-L1 adr1-L2 bak1-3 bkk1-1的高阶突变体,进一步证实ADR1参与BAK1缺失触发的植物免疫,且解释了BAK1缺失触发植物免疫的分子机理是因为NLR蛋白的激活。

The autoimmune phenotypes of bak1-3 bkk1-1require ADR1s


同时该研究巧妙地应用了合作者周俭民研究员(中科院遗传与发育研究所)实验室前期发现的一个细菌效应蛋白HopB1,将其在植物体内表达以模拟病原微生物侵染植物细胞时的真实情况,发现HopB1能特异性地剪切BAK1及其同源蛋白,造成BAK1及其同源蛋白功能的丧失,也可导致植物产生ADR1依赖的免疫激活反应。研究首次报道了位于植物细胞表面的重要植物类受体蛋白激酶(如BAK1)可以被NLR蛋白所监管,从而启动植物免疫自激活反应。所以BAK1缺失后触发植物免疫自激活的生物学意义就在于病原微生物侵染植物时会选择性地攻击BAK1,因为BAK1是多条PTI信号途径的共受体,攻击BAK1可以造成多条PTI信号途径的同时中断。但在植物与病原微生物的共进化过程中植物进化出了可以直接或间接监管着BAK1状态的NLR蛋白,一旦发现BAK1遭受病原微生物攻击就会导致NLR蛋白的激活,再次赋予植物相应的抗性免疫,使植物在遭受不同病原微生物威胁时既可以通过BAK1启动PTI免疫防御机制,又可以通过激活NLR蛋白启动更强烈的ETI免疫信号,从而抑制病原微生物对植物的进一步侵染。

A model to show BAK1 is directly or indirectly guarded by NLR-mediated signaling


近日,该研究结果以“Loss of the Common Immune Co-receptor BAK1 Leads to NLR-Dependent Cell Death”为题在PNAS上在线发表。该研究揭示了BAK1缺失后触发植物免疫自激活的分子机理,并完美解释了其生物学意义。在植物免疫领域具有重要的理论与实践意义。

兰州大学生命科学学院、细胞活动与逆境适应教育部重点实验室为论文第一完成单位。兰州大学生命科学学院博士生吴玉俊为论文第一作者,黎家教授、何凯教授为论文共同通讯作者。兰州大学已毕业博士生高阳、已毕业硕士生詹延延、在读博士研究生魁红、在读硕士研究生刘宏燕和鄢黎,图宾根大学Birgit Kemmerling教授和中科院遗传与发育研究所周俭民研究员共同参与了此项研究。本研究得到了国家自然科学基金、农业部和教育部基金的支持。

黎家课题组简介

黎家教授团队长期从事植物激素油菜素甾醇(BR)信号转导机制及类受体蛋白激酶生物学功能的研究,在相关研究领域取得了丰硕的创新性研究成果。BAK1为黎家教授在John C. Walker实验室做博士后期间研究BR受体BRI1时鉴定得到(Li et al., Cell, 2002),而bak1 bkk1的免疫自激活表型是由何凯教授在黎家实验室攻读博士学位期间首次发现 (He et al., Current Biology, 2007)。BAK1相关的免疫信号研究也是黎家教授团队常年致力深入挖掘的领域之一。

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    PNAS|兰州大学研究团队揭示BAK1缺失触发植物免疫反应的分子机制
    植物类受体蛋白激酶BAK1在调控植物生长发育的过程中具有重要作用,同时BAK1也作为共受体与多个位于细胞膜上的模式识别受体 (Pattern Recognition Receptors, PRRs) 形成受体复合体介导植物的PTI (PRR-triggered immunity) 响应。兰州大学黎家教授团队于2007年首次报道了BAK1及其同源基因BKK1的缺失突变可直接导致植物在正常培养条件或无
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    实验

    服务简介
    一、酵母单杂交

    酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

     

     二、酵母双杂交

    酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


    应用领域
    植物:自交不亲和机理研究

    病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

    信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

    癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

    寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

    基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

       

    项目名称

    内容

    交付标准

    服务周期

    酵母双杂文库构建

    RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

    酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

    25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

    酵母双杂文库筛选

    诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

    完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

    2个月左右

     

    订购信息

     

    文库构建流程

    总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

    单/双杂筛选流程

    诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

     

    样品要求
    细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
    筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

     案例分析

    1载体构建
    根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
    2自激活检测结果

      

                                         pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                                   pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

    实验现象结论

    对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

    结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

    3文库筛选

    4阳性克隆鉴定

     

          筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

    编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

     

    在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

     

    5)回转验证

     

    阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

     

    15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

     

    结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

     

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