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PBJ|浙江大学研究人员通过酵母杂交技术揭示AP2/ERF家族成员通过调节柑橘中IV型查尔酮异构酶来调节类黄酮的合成

 核心提示

黄烷酮和黄酮是生物活性化合物的极好来源,但它们高效生产的分子基础仍然难以捉摸。查尔酮异构酶(CHI)家族蛋白在黄酮类化合物生物合成中起着重要作用,但对控制其基因表达的转录因子知之甚少。


近日,浙江大学研究人员在期刊Plant Biotechnology Journal上发表了一篇名为“Three AP2/ERF family members modulate flavonoid synthesis by regulating type IV chalcone isomerase in citrus”的文章,研究人员从柑橘中鉴定出一种第四类柑橘类黄酮(命名为CitCHIL1),它能增强柑橘类黄酮和黄酮(CFLs)的积累。

 

CHIL对CHS蛋白的物理相互作用和调节作用

根据酵母双杂交(Y2H)试验结果,CitCHIL1可分别与CitCHS1、CitCHS2和CitCHI相互作用。然而,CHILL 1与CitCHI的相互作用弱于CHS蛋白,含有CHILL 1/CHI的酵母在选择性培养基上生长不良。双分子荧光互补(BiFC)分析和萤火虫荧光素酶互补成像(LCI)分析的结果在体内提供了支持这一结论的直接证据。只有当融合蛋白具有相同的亚细胞定位和直接相互作用时,才能检测到YFP信号和LUC信号。在LCI试验中,在相同的成像参数下,CHIL/CHI复合物的荧光强度低于CHIL/CHS复合物,支持Y2H试验的结果。

 

CitCHIL1和其他EBGs编码的蛋白质之间的物理相互作用

 

AP2/ERF家族转录因子对CitCHIL1启动子的激活作用

三种转录因子,即CitERF32、CitERF33和citr av1被证实能够通过双荧光素酶分析在烟叶中激活CitCHIL1启动子,增量分别为2.1倍、2.3倍和2.3倍。有趣的是,所有这些都是AP2/ERF家族的成员。系统发育分析表明,CitERF32和CitERF33与拟南芥中的DREB2D和DREB2F同源。尽管CitERF32和CitERF33都是DREB亚家族A-2的成员,但它们在氨基酸水平上的相似性很低,除了AP2结构域。对这三种转录因子转录水平的逆转录聚合酶链反应分析证实了核糖核酸序列的结果,并提供了关于空间表达的信息。柠檬醛1主要在果实和成熟叶片中表达,从S2到S6在果实中表达略有上升。CitERF33与CitCHIL1具有相似的组织特异性,其转录本丰度在花和幼叶中高于果实。亚细胞定位分析显示,所有这三种转录因子都定位在细胞核中。

激活CitCHIL1启动子的转录因子的鉴定

 

综上所述,研究人员发现CitCHIL1通过参与黄酮类化合物的代谢,促进柑橘中黄酮类化合物的合成,从而提高了柑橘类水果的加工效率。CitCHIL1基因被三个AP2/电流变流体转录因子转录激活,一个DREB-RAV复合物显著增强CitCHIL1的转录和柑橘类黄酮的积累。这些结果对进一步理解和操作黄酮类化合物的作用机制具有重要意义。

文章链接https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13494


PBJ|浙江大学研究人员通过酵母杂交技术揭示AP2/ERF家族成员通过调节柑橘中IV型查尔酮异构酶来调节类黄酮的合成
黄烷酮和黄酮是生物活性化合物的极好来源,但它们高效生产的分子基础仍然难以捉摸。查尔酮异构酶(CHI)家族蛋白在黄酮类化合物生物合成中起着重要作用,但对控制其基因表达的转录因子知之甚少。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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