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New Phytologist|广西大学金健课题组揭示水稻miR164靶向CUC1 基因作用于分生组织/器官边界特化

高等植物的大部分地上部分来自茎顶端分生组织。在SAM中,分生组织/器官原基与其周围环境之间边界的形成对器官的形成至关重要。在拟南芥中,杯状子叶(CUC)基因CUC1和CUC2编码一对副同源的NAC转录因子,并由microRNA miR164负调控,已被证明参与胚胎SAM的形成和边界的确定。由于CUC1和CUC2在功能上是多余的,cuc1和cuc2单突变体都没有表现出严重的幼苗表型,而cuc1和cuc2双突变体表现出严重的子叶融合和缺乏SAM。另一个NAC基因家族成员CUC3是CUC1和CUC2的同源物,也与CUC1和CUC2冗余地参与子叶边界和茎分生组织的建立。虽然许多NAC基因在水稻中已被鉴定,但它们是否参与分生组织或器官边界的确定仍不清楚

 

近日,广西大学金健课题组在New Phytologist上发表一篇名为“The osa-miR164 target OsCUC1 functions redundantly with OsCUC3 in controlling rice meristem/organ boundary specification”的文章,本文研究揭示了水稻中osamiR164c、OsCUC1以及OsCUC3之间的互作作用于器官边界特化


OsCUC1和OsCUC3的表达谱

NAC家族蛋白已显示出起转录因子的作用。由于OsCUC1和OsCUC3编码NAC域蛋白,使用GFP荧光通过在水稻原生质体中瞬时表达OsCUC1-GFP或OsCUC3-GFP框内融合蛋白来确定其亚细胞定位。结果显示,OsCUC1和OsCUC3都位于细胞核内。另外,为了确定这些基因是否具有反式激活活性,将OsCUC1和OsCUC3与GAL4 DNA结合结构域融合并转化入酵母菌株AH109中。含有pBD-OsCUC1的酵母菌株pBD-OsCUC3或pBD-OsCUC3在Trp,His和Ade缺陷型SD培养基中生长,而阴性对照在三缺陷SD培养基中不生长,这表明两个基因都具有反式激活活性。总而言之,这些数据表明OsCUC1和OsCUC3起着转录因子的作用。

 

使用qRT-PCR研究整个植物发育过程中OsCUC1和OsCUC3的表达模式。OsCUC1在叶,片,旗叶和生殖器官,尤其是雄蕊中高度表达。与OsCUC1相比,在所有测试器官中OsCUC3的表达水平均较低。但是,OsCUC3转录本在营养器官中的积累要比在生殖器官中的积累得多。为了获得这两个基因表达模式的细节,我们进行了原位杂交测定。

 

 


水稻中OsCUC1OsCUC3的表达模式

 

OsCUC1与CLD1物理相互作用并维持CLD1在细胞核中的稳定性,以控制叶片形态

敲除水稻中的OsCUC1会导致叶片发育缺陷,类似于卷曲的叶片和矮化1(cld1)突变体的表型。为了验证CLD1是否可以与OsCUC1相互作用,首先测试了CLD1是否像OsCUC1一样位于细胞核中。在水稻原生质体中与核定位标记或膜定位标记瞬时共表达CLD1-GFP框内融合蛋白。绿色荧光蛋白荧光表明CLD1位于膜和细胞核中。此外,通过免疫印迹在细胞核富集部分中检测到CLD1-GFP。该结果进一步证实了CLD1的核定位。然后研究了CLD1和NAC蛋白之间的蛋白相互作用。总体而言,OsCUC1和CLD1之间的蛋白质相互作用可能使CLD1在细胞核中稳定。OsCUC1功能的丧失可能导致CLD1在细胞核中加速降解,从而导致叶片卷曲的表型,类似于cld1突变体的表型。


 


OsCUC1与水稻中的CLD1相互作用

 

植物分生组织/器官边界的特化对于植物的发育是至关重要的。文章中,研究人员发现两个之前未曾有过功能鉴定的NAC转录因子:由osamiR164c负调控的OsCUC1会与OsCUC3形成二聚体,功能部分冗余地作用于水稻分生组织/器官边界的特化。作者构建了水稻OsCUC1和OsCUC3的功能敲除突变体,以及osamiR164c的过表达株系,用以研究水稻中器官边界特化的分子机制;其中,OsCUC1是拟南芥中CUC1和CUC2的同源基因,而OsCUC3与拟南芥的CUC3为同源基因。无论是OsCUC1的突变或是OsCUC3的突变,都会导致分生组织/器官边界的建立缺陷,从而导致雄蕊数量减少,叶片与花丝的融合,而且这些缺陷表型在双突植株中得到明显增强。osamiR164c过表达的转基因植株的表型与OsCUC1敲除株系的表型相似。另外,OsCUC1的敲除还会导致多个缺陷,包括植株结构变矮、雄性不育以及卷曲的叶片。进一步的研究显示OsCUC1会与一个叶片卷曲相关蛋白CLD1互作,能够在细胞核稳定该蛋白,从而控制叶片的形态。 

 

文章链接:https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/nph.16939


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New Phytologist|广西大学金健课题组揭示水稻miR164靶向CUC1 基因作用于分生组织/器官边界特化
近日,广西大学金健课题组在New Phytologist上发表一篇名为“The osa-miR164 target OsCUC1 functions redundantly with OsCUC3 in controlling rice meristem/organ boundary specification”的文章,本文研究揭示了水稻中osa‐miR164c、OsCUC1以及OsCUC3之间的
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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