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Plant Physiology|浙江大学金崇伟教授团队研究揭示硝酸盐转运体促进K+ 的吸收和分配的分子机制

钾是植物生长发育的必需元素,在农业生产中有助于决定作物的产量和品质。然而,大多数土壤中可溶性钾离子的浓度相对较低,这往往限制了植物的生长。尽管向农田施用大量钾肥可以提高作物的产量,但只有大约一半的施用肥料可供植物使用,而剩余的肥料在土壤中积累为残留物,从而导致环境污染。因此,为了提高植物对钾离子的利用效率,迫切需要更全面地了解钾离子转运和调节的分子机制。

 

近日,Plant Physiology 杂志在线发表了来自浙江大学金崇伟教授团队的题为“The K+ and NO3- interaction mediated by NITRATE TRANSPORTER 1.1 ensures better plant growth under K+ -limiting conditions” 的研究论文。该文章研究揭示了硝酸盐转运体NRT1.1与根表皮-皮层和根部中央维管中K+ 通道/转运体的相互协调,促进K+ 吸收和分配的分子机制。

拟南芥中NRT1.1 对低K+ 胁迫作出响应的示意图



NRT1.1改善植物的钾营养,钾限制条件刺激根中NRT1.1 1的活性

研究人员为了确定NRT1.1赋予在含有足量NO3-的生长培养基上培养的植物对钾缺乏的耐受性的机制。对足量和低钾离子处理的反应,发现nrt1.1-1、chl1-5和chl1-6突变体的钾离子水平明显低于对照相应的野生型植物,表明缺乏NRT1.1活性扰乱了植物的钾营养。然而,当植物在含有低NO3- (0.2毫米)的培养基中生长时,我们检测到个NRT 1.1-空突变体和野生型植物在充足和低钾+处理中的生长或钾+水平没有显著差异。因此,这些结果表明NRT1.1在改善植物钾营养中的作用依赖于NO3-的充足供应。

拟南芥需要NRT1.1来维持K+营养

拟南芥需要NRT1.1来维持K+营养


钾离子的吸收和根冠分配都需要NRT1.1的协调

研究人员对分布在植物的根和芽中的钾离子比例的测定显示,当生长在低钾离子培养基上时,nrt1.1-1和chl1-5突变体的特征在于分布在芽中的钾离子比例低193%,但与Col-0植物相比,分布在根中的比例高。相比之下,当在足量的钾离子培养基上生长时,我们检测到在Col-0植物和nrt1.1敲除突变体的芽和根中分布的钾离子的比例没有显著差异。基于这些观察,我们可以推断尽管只是在钾离子限制的条件下,NRT1.1在钾离子的根冠分配中也起着明显的作用。

拟南芥钾离子的吸收和根冠分配都需要NRT1.1

 

 

钾离子和NO3-是大多数陆生植物根系吸收的钾和氮的主要形式。在这项研究中,研究人员观察到拟南芥中NO3-和K+之间的密切关系是由硝酸盐转运蛋白1.1 (NRT1.1)介导的。nrt1.1敲除突变体表现出K+ 吸收和根冠分配受到干扰,并以在K+限制条件下生长停滞为特征。通过分别使用硫酸盐转运体1;2 和PHOSPHATE1 启动子在根表皮-皮层和中央维管 中表达NRT1.1,这些突变体的K+ 吸收和根到茎的分配得到部分恢复。基于nrt1.1-  1/K+转运蛋白1、nrt 1.1-1/高亲和力K+转运蛋白5-3、nrt1.1-1/K+吸收通透酶7和nrt1.1- 1/stelar K+外向整流蛋白2双突变体和相应的单突变体和野生型植物中的K+含量的双向方差分析揭示了nrt1.1和位于根表皮-皮层和中央脉管系统中的K+通道/转运蛋白之间的生理相互作用。进一步的研究表明,这些钾离子吸收相关的相互作用依赖于与由NRT1.1介导的H+/NO3-共转运相关的H+消耗机制。

拟南芥钾离子的吸收和根冠分配都需要NRT1.1

拟南芥中NRT1.1 对低K胁迫作出响应的示意图


总之,这些数据表明,NRT1.1在根表皮-皮层和中央脉管系统中的表达模式分别与钾离子通道/转运蛋白协调以改善钾离子吸收和根-茎分配,这反过来确保了在钾离子限制条件下更好的生长。

 

文献链接; http://www.plantphysiol.org/content/early/2020/10/22/pp.20.01229

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Plant Physiology|浙江大学金崇伟教授团队研究揭示硝酸盐转运体促进K+ 的吸收和分配的分子机制
钾是植物生长发育的必需元素,在农业生产中有助于决定作物的产量和品质。然而,大多数土壤中可溶性钾离子的浓度相对较低,这往往限制了植物的生长。尽管向农田施用大量钾肥可以提高作物的产量,但只有大约一半的施用肥料可供植物使用,而剩余的肥料在土壤中积累为残留物,从而导致环境污染。因此,为了提高植物对钾离子的利用效率,迫切需要更全面地了解钾离子转运和调节的分子机制。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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