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CUT&Tag 蛋白质—DNA互作研究新方法

告别CHIP-Seq,新一代蛋白质—DNA互作研究-CUT&Tag重磅来袭


什么是CUT&Tag?


CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是蛋白质-DNA 互作关系研究的新方法,是一种使用 protein-A-Tn5( pA-Tn5 ) 转座体融合蛋白的连接方法。在 CUT&Tag 中,通透性细胞或细胞核与特定染色质蛋白的抗体孵育,然后负载嵌镶末端接头的 pA-Tn5 被连续地连接到抗体结合位点。通过添加镁离子激活转座体,导致接头整合到附近的 DNA。然后这些基因被扩增,生成测序库。是一种超微量的研究技术,适用于无 ChIP 级别抗体的蛋白研究。与传统的 ChIP-Seq 研究方法相比,该技术无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作,因此具有省时高效、所需的样品量少、背景信号低和可重复性好等优点,甚至可用于单细胞水平测序。CUT&Tag 有望将蛋白质-DNA 互作的研究变成一种类似 PCR 反应的常规操作,经过 PCR 扩增后形成可以直接用于高通量测序的文库,对基因调控、表观遗传等领域的研究具有革命性的意义。 

CUT&Tag方法原理

技术原理

ChiTag是Protein A蛋白与Tn5转座酶的融合蛋白,当抗体结合目的蛋白(如转录因子、组蛋白等)后,Protein A蛋白可直接结合抗体,携带的Tn5转座酶可特异性的切割目的蛋白附近的DNA片段,并将DNA片段连上接头,文库构建之后可进行高通量测序。 


CUT&Tag实验流程


产品优势 


样品起始量低:能够对及少量样品进行分析,可兼容低至 60 个细胞甚至单细胞 

超高活性:兼具 pG/A &Tn5 活性,DNA 片段化活性极高 

信噪比高:背景噪音低,所需测序深度少,信噪比显著优于 ChIP-Seq 

实验重复性好:平行样本之间的重复性好。实验重复结果保持一致 

CUT&Tag 技术方法简便易行,信噪比高,重复性好,需要的细胞数量少  


样本要求 

细胞、组织,其它样品信息请详询 

样品量:细胞:5×105;组织:5mg 

样品保存:细胞样品或新鲜组织块,液氮冻存后,-80℃ 保存 

样品运输:干冰运输 

 

案列解析

CUT&Tag文献


在生物学研究中,DNA 与蛋白质之间的互作是至关重要的,参与基因的表达、调控、复制、重组和修复以及 RNA 的转运、翻译和调控等多个过程,几乎涉及所有的生命活动。目前研究两者互作的方法很多,作者选择了传统的研究手段 ChIP-seq,优化的 CUT&RUN 方法,以及新方法 CUT&Tag 共同研究组蛋白 H3K27me3。通过比对实验结果,发现CUT&Tag 有最低的背景噪声以及最强的信号。通过对 H3K4me1 修饰物进行分析,显示 CUT&Tag 的灵敏度最高,实验可重复性最好。  

重复性相关矩阵:CUT&Tag 的灵敏度最高,实验可重复性最好 



 

CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq 实验结果对比:CUT&Tag 具有更好的信噪比和更 低的背景 



peak-Calling 的对比:CUT&Tag 比 CUT&RUN、ChIP-seq 或 ATAC-seq 有更高的信号 

研究结果

CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是一种可应用于表观遗传学领域的 DNA-蛋白质互作研究新技术,主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合或分布位点。 

    

CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)是替换传统的 ChIPSeq 用以研究蛋白质-基因组互作的新技术,与后者相比,它具有信噪比高、可重复性好、实验周期短(1 天实现从细胞到文库构建)、细胞投入量低等显著优势,尤其适用于早期胚胎发育、干细胞、肿瘤以及表观遗传学等研究领域。 

 

 

CUT&Tag 蛋白质—DNA互作研究新方法
CUT&Tag是蛋白质-DNA 互作关系研究的新方法,是一种使用 protein-A-Tn5 转座体融合蛋白的连接方法。是一种超微量的研究技术,适用于无 ChIP 级别抗体的蛋白研究。与传统的 ChIP-Seq 研究方法相比,该技术无需交联、超声打断、末端抹平和接头连接等操作,因此具有省时高效、所需的样品量少、背景信号低和可重复性好等优点,甚至可用于单细胞水平测序。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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