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Journal of Experimental Botany|西双版纳热带植物园研究人员揭示茉莉酸盐介导的植物对坏死性真菌病原体的防御机制

作为固着生物,植物不断的受到微生物病原体和食草动物的攻击。由于这些长期、持续的相互作用,植物已经成功地进化出复杂的防御机制进行自我保护。植物对病原体感染的防御反应是高度协调、连续的细胞水平变化的结果,其中植物激素起着重要作用。大量研究表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)是主要的防御激素。坏死性病原体,如灰葡萄孢、十字孢链格孢、尖孢镰孢和核盘菌,在园艺和农业作物中引起严重的毁灭性疾病,但是人们对植物抵抗这些真菌的能力知之甚少。


近日,中国科学院西双版纳热带植物园于迪秋团队在国际著名期刊Journal of Experimental Botany上发表文章“AtWRKY75 positively regulates jasmonate-mediated plant defense to necrotrophic fungal pathogens”,揭示了AtWRKY75正向调节茉莉酸(JA)介导的植物对坏死性真菌病原体灰霉病菌和十字孢链格孢菌的防御,并且还影响植物对JA抑制的种子萌发和根生长的敏感性。

文章来源

wrky75的突变和WRKY75的异位表达导致对灰霉和油菜素内酯的反应改变

 

为了研究拟南芥WRKY转录因子在植物防御反应中的功能,研究人员筛选了44个WRKY相关的T-DNA插入突变体和RNAi系,以鉴定可能参与植物基础防御的WRKY蛋白,分离出WRKY75的一个RNAi系并用于进一步表征。为了进一步证实WRKY75在防御灰霉病菌中的作用,研究人员还获得了另外两个wrky75 T-DNA插入突变体,即wrky75-1 (SALK_101367)和wrky 75-25(n 121522)。敲除WRKY75显著增强了对坏死性真菌病原体的敏感性。通过比较35S:WRKY75转基因植物和野生型植物中的病原体生长。然后选择显示正常植物形态并以与野生型植物相似的速率生长的两个转基因系。结果证实WRKY75在植物防御坏死性病原体中起重要作用。

wrky75的突变和WRKY75的异位表达导致对灰霉和油菜素内酯的反应改变

 

WRKY75在植物对坏死性真菌病原体的基础防御中起着积极的调节作用。用Northern印迹和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)及绿色荧光蛋白(GFP)的检测来检测WRKY75在感染过程中表达的诱导性和时间动力学。WRKY75的表达由灰霉病菌感染强烈诱导,由水杨酸、内皮素和茉莉酸轻度诱导,经内皮素和茉莉酸联合处理后诱导增强,其诱导的转录物积累部分依赖于COI1。与RNA凝胶印迹分析一致,GUS染色进一步证实了由灰霉病菌感染诱导的WRKY75的表达。为了进一步了解WRKY75的表达模式,还通过观察接种灰霉病菌的WRKY75:YFP-WRKY75:3¢-WRKY75转基因植物叶片中的黄色荧光蛋白(YFP)荧光来确定WRKY75蛋白在灰霉病菌感染时的积累。处理前未观察到YFP信号,而在受灰霉病菌感染的叶片中观察到强YFP信号。综上所述,这些结果表明WRKY75基因可能参与植物对坏死性真菌病原体的基础防御反应。

WRKY75的诱导表达

WRKY75的诱导表达 

 

坏死性真菌在园艺和农业作物中引起毁灭性的疾病,但是我们对植物对这些病原体的防御反应的了解仍然有限。在本研究中,研究证明了AtWRKY75正向调节茉莉酸(JA)介导的植物对坏死性真菌病原体灰霉病菌和十字孢链格孢菌的防御,并且还影响植物对JA抑制的种子萌发和根生长的敏感性。定量逆转录聚合酶链反应分析表明,一些JA相关基因的表达,如ORA59PDF1.2,在wrky75突变体中显著降低,在35S:WRKY75转基因植物中显著增强。免疫沉淀分析显示WRKY75直接结合ORA59启动子并抑制其转录。体内和体外实验表明WRKY75与几种茉莉酮酸ZIM结构域蛋白相互作用,这些蛋白是茉莉酮酸信号通路的阻遏物。我们确定JAZ8抑制WRKY75的转录功能,从而减弱其调节因子的表达。与这一发现一致,JAZ8的过表达抑制了植物对灰霉病菌的防御反应。综上所述,我们的研究提供了证据,证明WRKY75作为JA调节信号通路的关键组成部分,积极调节拟南芥对坏死性病原体的防御反应。

拟南芥调节的防御反应模型

拟南芥WRKY75调节的防御反应模型

 

Journal of Experimental Botany|西双版纳热带植物园研究人员揭示茉莉酸盐介导的植物对坏死性真菌病原体的防御机制
作为固着生物,植物不断的受到微生物病原体和食草动物的攻击。由于这些长期、持续的相互作用,植物已经成功地进化出复杂的防御机制进行自我保护大量研究表明,水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)是主要的防御激素。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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