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The Plant Journal| 南京农业大学郑录庆团队发现一种新的向水稻分蘖芽和穗输送锌的转运装置

分蘖数被认为是控制水稻穗数的最重要的农艺性状之一,在很大程度上决定了产量。分蘖的形成通常经历两个发育阶段:分蘖芽的形成及每个叶腋的生长。水稻的分蘖能力很大程度上取决于遗传变异和环境因素,如光、温度和养分供应。分蘖的形成及其活跃的生长需要大量的必需矿物质营养,但是分蘖的蒸腾作用通常很低。因此,需要一个与蒸腾作用无关的系统来优先向分蘖分配矿物质营养。然而,这种优先分配背后的机制在很大程度上是未知的。锌是许多蛋白质的辅因子,这些蛋白质参与许多重要的生化途径,包括碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸代谢。含锌蛋白质在DNA复制和基因表达调节中起关键作用。因此,发育中的组织需要大量的锌才能活跃生长。


近日,南京农业大学郑录庆教授联合日本冈山大学马建峰教授联合在国际著名期刊The Plant Journal上发表一篇名为“A transporter for delivering zinc to the developing tiller bud and panicle in rice“的文章,揭示了OsZIP4参与将锌转运到节中的深叶鞘韧皮部,随后分配到总叶鞘和其他发育组织,将被接受的锌转运到TBs的分生组织细胞中起了重要作用。

首先为了研究锌对水稻生长的影响,研究人员对植物进行了缺锌和没有缺锌的实验,发现缺锌植物分蘖芽受到抑制,说明锌是分蘖芽生长必须的。在对水稻基因样品OsZIP4进行表达分析时,发现在茎基部表达较高。用绿色荧光蛋白抗体对含有OsZIP4启动子与绿色荧光蛋白融合的水稻转基因株系进行免疫染色分析,结果显示锌缺乏增强了茎蘖芽中OsZIP4的表达,但不影响其定位的组织特异性。

缺锌对水稻分蘖芽生长的影响


研究人员获得2个OsZIP4敲除突变体,OsZIP4-1和OsZIP4-2,并将其与WT进行缺锌和锌充足培养,在添加OsZIP4的条件下,突变体分蘖芽生长情况得到改善。而在分蘖数上,WT也比突变体多,说明OsZIP4的表达对分蘖数也很重要。在含锌培养液中培养WT和突变体,发现突变体与WT总锌吸收量没有差异,在缺锌培养液中发现,突变体茎基部锌浓度高于WT,结果表明,敲除OsZIP4破坏了锌在发育组织中的分布,阻碍了植物对锌的吸收。


oszip4突变体、互补系和野生型水稻的分蘖芽生长和数量


这里我们发现锌向TB的分布是由OsZIP4介导的ZIP家族成员之一。OsZIP4在分蘖芽中高表达,由缺锌引起。免疫染色分析表明,OsZIP4主要表达于维管束的韧皮部和腋生分生组织中。OsZIP4突变不影响总锌吸收,但改变了锌的分布;营养生长期,施入到分蘖芽和新叶中的锌较少,但留在基茎中的锌较多。生物成像分析表明,突变体在基节膨大和过渡的维管束中异常积累锌,而在野生型中,在分生组织部分观察到高锌积累。在生殖阶段,OsZIP4的突变导致穗发育延迟,这与锌在穗中的分布减少有关。总的来说,OsZIP4参与将锌转运到节中的深叶鞘韧皮部,随后分配到总叶鞘和其他发育组织。它也在将被接受的锌转运到TBs的分生组织细胞中起作用。


The Plant Journal| 南京农业大学郑录庆团队发现一种新的向水稻分蘖芽和穗输送锌的转运装置
OsZIP4参与将锌转运到节中的深叶鞘韧皮部,随后分配到总叶鞘和其他发育组织。它也在将被接受的锌转运到TBs的分生组织细胞中起作用。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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