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The Plant Journal |华中农大谢国生团队揭示caleosins蛋白与Ca结合改善水稻耐盐胁迫

脂滴(LDs)存在于各种原核和真核细胞中。乳酸脱氢酶由三酰甘油(TAG)基质的疏水核心组成,由磷脂和独特蛋白质的单层包裹,这些蛋白质具有结构和代谢作用。Caleosins是一个保守蛋白质小家族,能够与钙(Ca2+)结合,并能在植物中的LD磷脂单层表面嵌入或附着油质蛋白样结构。已经证明,在许多细胞和生物过程中,Caleosins起着关键作用,这些过程与成熟阶段的合成或种子萌发过程中贮藏脂质的降解、脂质转运/周转以及植物中LDs的结构稳定密切相关。许多caleosins也与植物生长和发育以及水稻、拟南芥、芝麻、大麦、油菜籽和橄榄的非生物和生物胁迫反应有关。然而,caleosin家族蛋白5 (OsClo5)调节水稻耐盐性的机制尚未阐明。

 

2020年11月12日,华中农业大学谢国生团队在国际著名期刊“The Plant Journal”上发表论文“OsClo5 functions as a transcriptional co‐repressor by interacting with OsDi19‐5 to negatively affect salt stress tolerance in rice seedlings”为开发一种生物技术方法来改善水稻盐胁迫提供新见解.

 

Caleosins是一个小蛋白质家族,有一个钙结合EF-hand基序。它们参与调节植物的发育和对非生物胁迫的反应。然而,它们如何影响水稻的耐盐性在很大程度上是未知的。因此,进行了生化和分子遗传学实验,结果表明OsClo5能在体外结合钙和磷脂,并定位于水稻原生质体的细胞核和内质网。在萌发和幼苗早期,与野生型相比,过表达转基因品系和T-DNA突变品系分别表现出对盐胁迫的耐受性降低和增加。酵母双杂交、双分子荧光互补和Pull-down表明,OsClo5的EF-hand基序对其自身和OsDi19-5的相互作用至关重要。酵母单杂交、电泳迁移位移和双荧光素酶报告基因分析通过TACART顺式元件在两个盐胁迫相关靶基因OsUSP和OsMST的启动子中鉴定出OsDi19-5为转录阻遏物。此外,OsClo5增强了OsDi19-5在烟草瞬时系统中的抑制作用,这已被盐胁迫下水稻幼苗的qRT-PCR分析所证实。这些综合结果加深了对盐胁迫反应中caleosin作用的分子机制的理解。这些发现也将有助于提高水稻的耐盐性。

OsClo5过表达转基因株系和T-DNA突变株系苗期耐盐性研究

 

在这项研究中,OsClo5,一种在水稻中含有一个钙结合EF-hand基序的小caleosin家族蛋白,被鉴定为水稻萌发和幼苗期耐盐性的负共调节因子。此外,OsClo5的EF-hand基序(残基68-95)被发现是与其自身和水稻中的干旱诱导蛋白19-5 (OsDi19-5)相互作用所必需的。值得注意的是,我们的实验证明OsClo5通过烟草植物瞬时表达系统中启动子中的TACART顺式元件和水稻幼苗中的盐胁迫,增强了相互作用伙伴OsDi19-5对两个盐胁迫相关靶基因OsUSP和OsMST的转录抑制活性。这些数据加深了对钙蛋白酶影响盐胁迫反应的分子机制的理解,也强调了开发一种生物技术方法来改善水稻盐胁迫的潜力。

The Plant Journal |华中农大谢国生团队揭示caleosins蛋白与Ca结合改善水稻耐盐胁迫
在这项研究中,OsClo5,一种在水稻中含有一个钙结合EF-hand基序的小caleosin家族蛋白,被鉴定为水稻萌发和幼苗期耐盐性的负共调节因子。此外,OsClo5的EF-hand基序(残基68-95)被发现是与其自身和水稻中的干旱诱导蛋白19-5 (OsDi19-5)相互作用所必需的。
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实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

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