400-863-8520

TEL    025-57671761

图片展示

Nature plant |华中农大和南方科技大学揭示蓝光受体CRY2激活的分子机制

在植物生命过程中,光受体对于光调节植物生长和发育的至关重要。隐花色素是一种感光器,它在感知蓝光后传递信号。在拟南芥中,CRY1和CRY2,这两种隐花色素分别介导蓝光抑制下胚轴伸长和花分化的光周期控制。CRYs还在植物中发挥广泛的其他功能,包括调节昼夜节律、气孔开度、根系生长、渗透胁迫反应、避光和叶片衰老。

 

CRY包含两个结构域,N末端的PHR结构域和C末端的CCE结构域。PHR结构域可进一步分为α/β和α亚结构域,它们与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)非共价结合。在蓝光照射下,FAD经历光还原,形成FAD自由基(FADH)。也能发生寡聚化,形成寡聚体,产生的寡聚体对下游转录因子(包括的CIBs、PIF4、 PIF5等)结合亲和力增加,还通过结合调控因子(COP1–SPA)间接调节基因表达。与CRY光激活和信号转导研究的巨大进展相比,CRY失活机制的研究相对滞后,BIC-CRY复合体是如何聚集的,以及BIC抑制CRY的机制还有待探索。

 

2020年11月16日,华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室和生命科学技术学院殷平教授实验室Nature Plants发表了题为Structural insights into the photoactivation of Arabidopsis CRY2的研究论文,为BiC介导的CRYs失活的分子机制提供了见解,并为CRYs的光遗传学操作提供了新的思路。

文章来源


BICs在CRY2的抑制中起两个作用。一方面,BIC2抑制CRY2的光还原。BIC2的结合不会改变CRY2 PHR或FAD结合的整体结构,但会增加FAD和电子转移途径中残基之间的距离,并将质子供体D393的侧链旋转约52°,产生更长的d(HD393–N5ISO)。鉴于D393在光反应中的重要作用,研究人员认为这种改变可能阻止D393对FAD的质子化,从而干扰CRY2的蓝光依赖性光反应。

 

另一方面,BICs抑制光活化CRY2的寡聚化及其与信号伴侣的相互作用。CRYs的PHR结构域介导寡聚化和与CIBs的相互作用。此外,BICs似乎能阻止CRY PHR结构域依赖蓝光的构象变化。据报道,蓝光会导致衣藻光解酶同源物1 PHR43的α/β亚区的β-折叠明显丢失。在我们的BIC2-CRY2N复合物的结构中,BIC2显示出“U形锁”结构,其中BIC2中的螺旋1和螺旋4主要分别接触PHR的α和α/β子域。这种锁状结构可以紧密稳定CRY2 PHR结构域的构象。

BIC介导的CRY2失活模型

BIC介导的CRY2失活模型


该研究开发了一套方法,在制备冷冻电镜样品前用蓝光处理CRY2蛋白,在光照后极短的时间(<7s)内迅速将蛋白冷冻停留在寡聚激活状态。通过这种方法,成功解析了蓝光激活的CRY2四聚体状态的冷冻电镜结构,分辨率为3.1 Å(图1)。通过与此前报道的黑暗状态下单体CRY2的晶体结构比对以及化学计算,该研究发现,蓝光激活CRY2的FAD结合口袋的体积变大。通过生化分析验证发现,FAD结合口袋的松弛会导致CRY2蛋白的寡聚化。该研究阐明了CRY2光诱导寡聚化的分子机制,也阐明了FAD光还原如何导致其寡聚化的分子机理。

光激活的CRY2四聚体结构

光激活的CRY2四聚体结构


马羚博士为本论文第一作者,殷平教授和南方科技大学龚欣教授为共同通讯作者。上海同步辐射中心的BL17U1/BL19U1/BL19U2波束工作人员在数据采集过程中提供帮助,华中农业大学蛋白质研究中心的研究人员提供技术支持。

 

这项工作得到了国家科技部(2018YFA0507700)、国家自然科学基金(31722017、31870753)、霍英东教育基金(151021)和中央高校基础研究基金(2662017PY031)的资助。


阅读原文

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41477-020-00800-1


公众号二维码

Nature plant |华中农大和南方科技大学揭示蓝光受体CRY2激活的分子机制
长按图片保存/分享
图片展示

电话:400-863-8520;025-5767-1761

邮箱:order@bestofbest.top

地址:南京市栖霞区江苏生命科技园F7栋

图片展示

微信公众号

图片展示

微信小程序

版权所有 南京瑞源生物技术有限公司       苏ICP备20003978号      技术支持:飞色网络

Copyright © 瑞源生物

苏ICP备20003978号

实验

服务简介
一、酵母单杂交

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

 二、酵母双杂交

酵母双杂交及系统是一种鉴定和检测活细胞内蛋白质相互作用的研究方法,是在真核模式生物酵母中进行的,因其具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点,现已被应用于多个研究领域。分为膜蛋白和核蛋白双杂交。


应用领域
植物:自交不亲和机理研究

病毒:朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白筛选

信号通路:转录因子、雌激素α受体相互作用蛋白筛选

癌症医学:癌症相关蛋白、凋亡相关蛋白相互作用蛋白筛选

寄生虫医学:毒力因子致病机制研究、半乳糖凝集素互作蛋白筛选

基础原理研究:肌球蛋白、蛋白酶体调节因子相互作用蛋白筛选、受精卵发育

   

项目名称

内容

交付标准

服务周期

酵母双杂文库构建

RNA提取、反转录、 cDNA处理、基因与载体的连接、文库质粒提取、文库产品指标

酵母双杂交文库甘油菌、酵母双杂交文库质粒、文库构建报告、文库构建图片

25个工作日,如需转化酵母延长15个工作日

酵母双杂文库筛选

诱饵质粒构建与活测、与双杂库共转感受态酵母、文库筛选、阳性克隆鉴定、回转验证

完整的筛库流程实验报告、鉴定出的阳性克隆测序

2个月左右

 

订购信息

 

文库构建流程

总RNA提取——mRNA分离——cDNA合成——基因与载体的连接——文库质粒提取——文库产品指标

单/双杂筛选流程

诱饵质粒构建与活测——与单/双杂库共转感受态酵母——文库筛选——阳性克隆鉴定——回转验证——报告整理

 

样品要求
细胞样本:细胞数量大于1×10^7;动物样本:大于1 g;植物样本:大于2 g;总RNA:大于200 µg
筛选服务:客户提供诱饵基因或构建好的诱饵质粒

 案例分析

1载体构建
根据客户提供序列构建 BD 重组载体,进行引物设计和测序验证。
2自激活检测结果

  

                                     pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53 为阳性对照

                               pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC 为阴性对照

实验现象结论

对照菌株在 SD-TL 缺陷平板上都能正常生长,而仅有阳性对照可在 SD-TLHA缺陷平板生长。pGADT7+pGBKT7-ABC 转化子中随机挑选的 6 个菌落在 SD-TLHA 缺陷平板上不能生长,生长状态同阴性对照,因此不存在自激活。

结果:ABC 诱饵克隆没有自激活作用。

3文库筛选

4阳性克隆鉴定

 

      筛库阳性克隆 ADE2 和 HIS3 报告基因检测

编号 1-34 分别是筛到的 34 个初始阳性克隆,编号“+”为阳性对照,编号“-”为阴性对照。

 

在 ADE2 和 HIS3 报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照在SD-TL和SD-TLHA 都能正常生长,而阴性对照由于不会激活 ADE2 和 HIS3 报告基因,在 SD-TL 可以正常生长,但在缺少 Histidine 和 Adenine 这两种成分的 SD-TLHA 平板上不能生长。因此,在34个初始阳性克隆中,除 4、8、26、28、30、32、33、34 号之外均能在SD-TLHA 生长,表明激活了HIS3和ADE2 报告基因。

 

5)回转验证

 

阳性克隆回转验证 His Ade 报告基因检测

 

15 种阳性克隆在SD-TLSD-TLHA 缺陷平板的生长情况。标注“+”为阳性对照,标注“-”为阴性对照。

 

结果显示,15 个阳性克隆中 22 号不能激活 HIS3 ADE2 报告基因;其余均能激活 HIS3 ADE2 报告基因。

 

联系电话
400-8638520
联系电话
025-57671761
二维码
二维码