研究背景

小麦蓝矮病是我国西北麦区一种重要植原体病害,在我国西部地区危害严重。该病害由异沙叶蝉专化性传播,介体传毒成为病害流行的重要中心环节。本实验室前期通过免疫荧光标记研究发现WBD植原体免疫膜蛋白与介体异沙叶蝉肌动蛋自互作,说明IMP在植原体传播和致病过程中起关键作用。本研究以WBD植原体IMP为诱佴,利用膜蛋白酵母双杂交技术筛选感染WBD植原体的异沙叶蝉膜系统cDNA文库,筛选获得与异沙叶蝉互作的蛋白,以期为研究二者互作,进而通过阻断叶蝉传播途径控制病害发展。

研究方案

1.诱饵载体的构建及功能检测

根据WBD植原体IMP基因序列合成带有SfiⅠ酶切位点的诱饵序列,通过两端的酶切位点将目的基因构建到酵母双杂交的诱饵载体pBT3STE上。诱饵载体构建成功后,将pBT3STE-IMP+ postl-NubI、pBT3STE-IMP+pPR3-N、pTSU2-APP+ PNUBG-Fe65(阳性对照)和pTSU2-APP+pPR3N(阴性对照)通过LiAc的方法共转进酵母NMY32,在选择性培养基DDO(SD-Trp-Leu)、TDO(SD-Trp-Leu-His)、QDO(SD-Trp-Leu-His-Ade)上30°C培养3-4d观察菌落生长状态。

2.诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库

将诱饵载体pBT3STE-IMP和文库质粒共转NMY32酵母菌中,将转化子克隆涂布在QDO选择培养基平板上,30℃培养箱培养3-4d。从筛库平板中挑取直径大于1.5mm的单菌落,重复3次依然生长的克隆判定为阳性克隆。

3.二次互作验证及生物信息学分析

为避免假阳性,将获得的阳性酵母单克隆挑取后重新在QDO选择培养基上培养。对继续生长的阳性单克隆菌落进行β-半乳糖苷酶检测, β-半乳糖甘酶活性大于阴性对照则认为通过LacZ报告基因的检测。将阳性克隆质粒从酵母细胞中回收并测序,测序结果在NCB1BLASTX比对,同时进行 Gene Ontology(GO)注释以及 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路分析。

研究结果

1.诱饵载体的构建及功能检测

WBD植原体IMP具有2个跨膜区影响其在大肠杆菌中表达。因此本试验切除了跨膜区,对424bp的核心序列以及两端的SfiⅠ酶切位点进行全基因合成,诱饵质粒测序表明插入序列完全正确,载体构建成功。功能检测结果显示:pBT3STE-IMP+ pOstⅠ-Nubl在DDO、TDO、QDO培养基均能生长，说明诱饵载体在酵母中正确表达,激活下游报告基因:pBT3STE-IMP+pPR3-N不能在TDO、QDO培养基上生长,表明诱饵载体无自激活活性。

2.诱饵载体筛选异沙叶蝉cDNA文库

将诱佴载体pBT3STE-IMP与异沙叶蝉文库质粒共转酵母NMY32后得到的总菌落数为1.2×10^6CFU,转化效率为4.8×10^4CFU,符合文库筛选条件。诱饵载体从异沙叶蝉cDNA文库中筛选得到30个阳性克隆。测序结果经NCBI比对、分析,获得13个基因的非全长序列,编码8种候选蛋白。二次共转验证和B-半乳糖苷酶检测显示8种候选蛋白与WBD植原体IMP互作。

3.生物信息学分析

GO注释分析表明8种互作蛋白参与包括线粒体的电子运输、蛋白质折叠,基于微管蛋白的生物过程、信号转导、ATP合成、核酸代谢过程等;分子功能包括GTP酶活性、细胞骨架结构分子活性、质子跨膜转运、顺反异构酶活性、蛋白磷酸酶活性等。8种互作蛋白存在线粒体、核糖体、细胞骨架和细胞质中。参考KEGG数据库,这些蛋白参与内吞作用、能量代谢、运输和分解代谢通路等。