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膜酵母双杂交实验案例|水稻水通道 OsPIP1;3与白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1互作关系研究

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-03-09 10:08:12

文章通过片段缺失和定点突变的方法构建产生水稻(Oryza sativa)水通道蛋白OsPIP1;3的变异本。通过膜酵母双杂交进行蛋白互作分析,实验结果表明水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)蛋白H|pa1能与OsPIP1;3互作,但如果将OsPIP1;3的一个胞外序列(1oop E)及OsPIP1;3的第六个跨膜区域(TM6)删除,则互作不能发生。进一步对276—279 aa进行替换,OsPIP1;3与Hpa1不再发生互作。这些结果说明,OsPIP1;3序列上的loop E和TM6上的氨基酸对OsPIP1;3—Hpa1互作有重要影响,而276-279 aa是可能的互作位点。

 

实验步骤:

1.引物设计:应用引物设计软件Primer Premier 5,以pMetYCgate::OsPIP1;3为模板,设计含有不同缺失片段的载体引物以及点突变载体引物


2.突变载体的构建


3.膜酵母双杂交实验

split.ubiquitin膜蛋白酵母双杂交系统是将两个待检蛋白分别与突变且相互分离的泛素N端(即NubG,Nub的13位亮氨酸突变甘氨酸)和C端(即Cub)相融合,两个待检测蛋白若存在互作,可使被分裂的泛素N端和C端相互接近,从而被泛素专一性蛋白酶(ubiquitin.specific proteases,UBPs)识别并导致报告蛋白(转录激活因子或酶等)解离释放,进而判定蛋白互作情况。与传统的酵母双杂交系统相比,split—ubiquitin膜蛋白酵母双杂交系统不再依赖传统的核内转录激活机制,可广泛用于细胞膜和细胞质内蛋白互作的研究。

 

实验结果:

1.    基因片段缺失及定点突变载体的构建片段大小正确,条带可见,测序正确,成功获得了本实验所需要的含有突变位点的重组质粒。

含OsPIP1;3突变体质粒的电泳分析结果

2.    互作区域的确定

首先,应用膜酵母双杂交系统对OsPIPl;3三个缺失载体进行蛋白互作检测,结果显示,Hpal与OsPIP1;3的互作位点位于144~288 aa区域内。进一步地,对144~288 aa范围内再次进行区段分割,并用测序正确后的O sPIPl;3片段缺失突变体进行酵母双杂交实验,结果显示,Hpal和OsPIPl;3的互作区域为246~279 aa,该区段包含Loop E和TM6跨膜结构域。

Hpal和OsPIPl;3互作区域的鉴定

 3.    互作位点的筛选

实验中,以含有点突变的OsPIPl:3为诱饵,以Hpal蛋白为猎物进行酵母双杂交检测。实验发现,当276-279 aa由缬氨酸一缬氨酸~缬氨酸一异亮氨酸突变为谷氨酸一谷氨酸一谷氨酸一天冬酰胺后,含有该突变的OsPIP1;3(muOsPIPl;3)~lHpal的酵母菌在三缺和四缺的培养基上不再生长且X—Gal处理不再显色,而含有未经突变OsPIPl;3与Hpa1同时转酵母菌则能在三缺和四缺板上正常生长,并且X—Gal处理显蓝色。上述结果表明,276-279 aa很有可能就是OsPIP1;3和Hpal蛋白的互作位点。

Hpal 与OsPIP1;3突变载体的酵母双杂交实验及X-Gal染色结果

  

膜酵母筛选体系简介

DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来,是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统,泛素可以分成两部分表达,即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub),后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在细胞中组成可分离的泛素蛋白体系,断裂的泛素的两部分分别连接一个蛋白,且两个蛋白之间存在相互作用。它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法,使得分析膜蛋白间的互作成为现实。

 

膜系统原理

泛素(ubiquitin)可以分成两部分:N端(Nub)和C端(Cub)。

Nub与Cub有很强的亲和力,当在同一细胞同时表达时,Nub与Cub会结合形成完整的泛素,会被泛素蛋白酶(UBPs)识别并切割。

Nub第三位的异亮氨酸突变成甘氨酸后(NubI→NubG),Nub与Cub的亲和力大大降低。

Cub融合转录因子LexA-VP16,诱饵构建在Cub上,猎物构建在NubG上。

当诱饵与猎物互作,使得Cub与NubG靠近而形成完整的泛素,UBPs识别并切割。

被切下的转录因子LexA-VP16 进入核内,启动报告基因(His,Ade,LacZ)的表达。

 

技术优点

在体内原位检测蛋白-蛋白间的相互作用而无需核定位信号

使用小的泛素结构域(NubG/Cub)使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化

此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用

任何一种膜蛋白都能作为诱饵,能使与待检测蛋白融合的相互作用模块(Cub-PLV-NubG)定位细胞质内

蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白(UBPs)剪切人工转录因子(LexA)启动,而不是靠转录,因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列


膜酵母双杂交实验案例|水稻水通道 OsPIP1;3与白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1互作关系研究
实验结果表明水稻白叶枯病菌蛋白H|pa1能与OsPIP1;3互作,但如果将OsPIP1;3的一个胞外序列及OsPIP1;3的第六个跨膜区域删除,则互作不能发生。进一步对276—279 aa进行替换,OsPIP1;3与Hpa1不再发生互作。这些结果说明,OsPIP1;3序列上的loop E和TM6上的氨基酸对OsPIP1;3—Hpa1互作有重要影响,而276-279 aa是可能的互作位点。
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